【摘要】： γc家族細(xì)胞因子對(duì)人NK細(xì)胞發(fā)育及調(diào)節(jié)功能的影響 自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK細(xì)胞)因其無需有抗原存在或預(yù)先加以致敏就可以殺傷某些腫瘤細(xì)胞而被命名，它不表達(dá)典型的抗原識(shí)別受體(如TCR和BCR)，在通常狀況下只存在于外周血、脾臟和骨髓中，但在趨化因子的作用下可游走到炎癥部位發(fā)揮作用。NK細(xì)胞通過其細(xì)胞毒活性和產(chǎn)生的細(xì)胞因子，在機(jī)體抗感染、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和造血調(diào)控等方面發(fā)揮重要的功能，是先天免疫中的一類十分重要的淋巴細(xì)胞。此外，NK細(xì)胞還是一種重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，可以通過分泌多種細(xì)胞因子如GM-CSF、IFN-γ、TNF-α等調(diào)節(jié)天然和獲得性免疫應(yīng)答，也可以通過細(xì)胞間的接觸來活化或抑制其他免疫細(xì)胞。NK細(xì)胞調(diào)節(jié)功能的研究是近年免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。 目的 NK細(xì)胞的發(fā)育分化在天然免疫和獲得性免疫的形成中占有十分重要的地位，NK細(xì)胞發(fā)育不良或功能缺陷所致威脅遠(yuǎn)大于T細(xì)胞和B細(xì)胞。在造血干細(xì)胞的發(fā)育分化中，髓系和淋巴系中的各類細(xì)胞均有較為詳盡的描述，而NK細(xì)胞的研究卻較少。不同分化階段NK細(xì)胞接受各種刺激因子作用后功能和表型的變化，增殖特性的變化以及信號(hào)傳導(dǎo)途徑的變化均有益于了解NK細(xì)胞的本質(zhì)及相關(guān)疾病。目前認(rèn)為NK細(xì)胞的發(fā)育和成熟主要依賴于骨髓微環(huán)境，是一個(gè)極其復(fù)雜的生理過程，受到一系列細(xì)胞因子的調(diào)控，其中IL-2和IL-15是最重要的兩個(gè)細(xì)胞因子。lL-2和IL-15是兩種不同來源但具有相似的結(jié)構(gòu)和功能的細(xì)胞因子，因?yàn)槎吖灿肐L-2受體βγ亞單位，激活相同的信號(hào)通路，所以它們有許多相似的生物學(xué)效應(yīng)，而且都能誘導(dǎo)CD34~+造血干細(xì)胞分化為CD56~+NK細(xì)胞。但是在越來越多地研究中表明，IL-2和IL-15的功能明顯不同。IL-2~(-／-)和IL-15~(-／-)以及IL-2Rα~(-／-)和IL-15Rα~(-／-)缺陷鼠表現(xiàn)出的癥狀缺陷有著明顯的差異。因此我們推測(cè)IL-2和IL-15在調(diào)節(jié)NK細(xì)胞發(fā)育中存在著差異。 NK細(xì)胞據(jù)其表面CD56分子表達(dá)密度的不同，分為CD56~(bright)和CD56~(dim)兩群。CD56~(dim)NK細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)的殺傷活性，而CD56~(bright)NK細(xì)胞殺傷活性較低。CD56~(bright)NK細(xì)胞能分泌大量的細(xì)胞因子，且在IL-2的作用下表現(xiàn)出較強(qiáng)的增殖作用；而CD56~(dim)NK細(xì)胞幾乎不分泌細(xì)胞因子，且IL-2不能促其增殖。然而NK細(xì)胞兩亞群的分化過程并不是很清楚，在IL-15的作用下從CD34~+造血干細(xì)胞發(fā)育分化而來的CD56~+NK細(xì)胞，從表型和功能上都類似于外周血中CD56~(bright)NK細(xì)胞。而在外周血中占絕大多數(shù)的主要執(zhí)行殺傷功能的CD56~(dim)NK細(xì)胞的發(fā)育分化途徑并不清楚，據(jù)推測(cè)它可能在某些刺激因素的作用下從CD56~(bright)NK細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來，也有可能是由與CD56~(bright)NK細(xì)胞共同或不同的前體細(xì)胞發(fā)育而來。 從功能上分析，CD56~(dim)NK細(xì)胞類似于效應(yīng)性T細(xì)胞，而CD56~(bright)NK細(xì)胞與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能相近。IL-2和IL-15對(duì)效應(yīng)性T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的作用有著明顯的差異：IL-2可以活化CD8~+CTL細(xì)胞，并誘導(dǎo)其AICD(activation-induced cell death，活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡)，而對(duì)Treg有較強(qiáng)的促增殖作用；IL-15可以維持CD8~+CTL的生存，抑制其凋亡。因此我們推測(cè)IL-2和IL-15對(duì)CD56~(bright)和CD56~(dim)NK細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用也存在著差異。 臍血中含有大量未成熟的細(xì)胞和造血前體細(xì)胞，具有分化潛能，研究這些細(xì)胞在IL-2和IL-15作用下的發(fā)育分化情況，將有利于發(fā)現(xiàn)某些NK細(xì)胞發(fā)育分化的線索，以及IL-2和IL-15在其中的不同作用，為以NK細(xì)胞為基礎(chǔ)的腫瘤生物治療提供理論依據(jù)。 結(jié)核病是一種嚴(yán)重危害人類健康的傳染病，近年隨著耐藥變異結(jié)核菌的不斷出現(xiàn)，結(jié)核病又有流行趨勢(shì)。目前的研究表明，γδT細(xì)胞是機(jī)體抗結(jié)核免疫反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞之一，活動(dòng)期結(jié)核病患者外周血中γδT細(xì)胞處于活化狀態(tài)，可以直接或間接殺傷被感染的細(xì)胞。活化的NK細(xì)胞雖然可以直接殺傷被結(jié)核桿菌感染的細(xì)胞，但是在多耐藥結(jié)核病患者體內(nèi)NK細(xì)胞的功能明顯降低，而其體內(nèi)γδT細(xì)胞的數(shù)量減少，活性下降。人體內(nèi)NK細(xì)胞和γδT細(xì)胞活化狀態(tài)的變化提示二者可能存在某種聯(lián)系。 NK細(xì)胞不僅是一種重要的免疫效應(yīng)細(xì)胞，也是一種重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞。NK細(xì)胞可以通過分泌多種細(xì)胞因子如GM-CSF、IFN-γ、TNF-α等調(diào)節(jié)天然免疫和獲得性細(xì)胞免疫應(yīng)答，也可以通過細(xì)胞-細(xì)胞間的接觸來活化或抑制其他免疫細(xì)胞。研究NK細(xì)胞對(duì)γδT細(xì)胞的調(diào)節(jié)機(jī)制，將有利于為結(jié)核病的免疫治療提出一種新的治療理念和方案，同時(shí)希望能為NK細(xì)胞基礎(chǔ)功能的研究提出一些新的觀點(diǎn)。 方法 1．分離CBMC，加入IL-2和IL-15進(jìn)行培養(yǎng)，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)CD3、CD16、CD25、CD34、CD56、CD94、CD117、CD122、CD132、CD158a、CD161、IL-15Rα等表面標(biāo)志的變化； 2．利用CFSE染色技術(shù)，檢測(cè)特定細(xì)胞亞群的增殖情況； 3．利用胞內(nèi)細(xì)胞因子染色技術(shù)，檢測(cè)特定細(xì)胞IFN-γ的分泌情況； 4．利用MACS和FACS純化細(xì)胞，檢測(cè)特定純化細(xì)胞在不同刺激因素作用下的變化情況； 5．利用Annexin V染色和胞內(nèi)Bcl-2和Bcl-xL染色，分析細(xì)胞亞群的凋亡情況； 6．利用~(51)Cr檢測(cè)NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的殺傷活性； 7．分離PBMC，加入M．tb Ag和／或IL-2進(jìn)行培養(yǎng)，檢測(cè)細(xì)胞表面分子表達(dá)變化的情況，分析細(xì)胞亞群的比例變化和細(xì)胞表型的改變； 8．利用ELISA試劑盒，檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中各種細(xì)胞因子的表達(dá)情況； 9．利用激光共聚焦顯微鏡和熒光抗體，觀察細(xì)胞-細(xì)胞之間的免疫突觸，及相關(guān)分子在細(xì)胞表面分布的情況。 結(jié)果 1．1L-2和IL-15對(duì)臍血NK細(xì)胞產(chǎn)生不同的作用。 在長(zhǎng)期體外培養(yǎng)中，低劑量IL-15促進(jìn)臍血NK細(xì)胞增殖的效果十分明顯。IL-2和IL-15都能提高NK細(xì)胞的殺傷活性和分泌IFN-γ的能力，IL-2的作用迅速而短暫，而IL-15的作用則緩和而持久。IL-15可以促進(jìn)CD56~(bright)和CD56~(dim)NK細(xì)胞的增殖，并維持其長(zhǎng)期存活。IL-2對(duì)臍血NK細(xì)胞只在早期表現(xiàn)促增殖作用，且對(duì)CD56~(bright)NK細(xì)胞的作用強(qiáng)于CD56~(dim)NK細(xì)胞。此外，IL-2可以誘導(dǎo)CD56~(dim)NK細(xì)胞的AICD，而IL-15則通過誘導(dǎo)Bcl-xL的高表達(dá)來發(fā)揮抗凋亡的作用。無論是IL-2還是IL-15培養(yǎng)，抗凋亡分子Bcl-2和Bcl-xL在CD56~(bright)NK上的表達(dá)都高于CD56~(dim)NK細(xì)胞。此外，IL-15可以誘導(dǎo)NK細(xì)胞特別是CD56~(bright)NK細(xì)胞表達(dá)CD25，而IL-2無此作用。 2．IL-2和IL-15對(duì)臍血T細(xì)胞的影響存在差異。 IL-2對(duì)臍血T細(xì)胞的促增殖作用強(qiáng)于IL-15，而且IL-2能誘導(dǎo)T細(xì)胞高表達(dá)CD25。 3．臍血與成人外周血NK細(xì)胞的表型存在差異。 新鮮分離CBMC和PBMC，F(xiàn)ACS檢測(cè)結(jié)果顯示，臍血NK細(xì)胞的主要表型為CD56~(+／-)CD16~(bright)，與外周血NK細(xì)胞的主要表型CD56~(dim)CD16~+，有較大的不同。成人外周血CD56~+NK細(xì)胞的比例為13.27±3.84％，明顯低于臍血(25.26±7.34％)。臍血NK細(xì)胞還表達(dá)CD94、CD122(IL-2Rβ)、CD132(IL-2Rγ)、CD158a等分子，少量表達(dá)CD25(IL-2Rα)。此外臍血中還含有2-4％的CD34~+細(xì)胞，而正常成人外周血不存在該種細(xì)胞。 4．IL-2和IL-15對(duì)成人外周血NK細(xì)胞的影響較弱。 低劑量IL-2和IL-15對(duì)成人外周血NK細(xì)胞和T細(xì)胞的促增殖作用都較弱，且二者無顯著性差異。 5．NK細(xì)胞正向調(diào)節(jié)γδT細(xì)胞的功能。 NK細(xì)胞的功能狀態(tài)與γδT細(xì)胞的增殖正相關(guān)；清除NK細(xì)胞的PBMC(NK-depleted PBMC)中γδT細(xì)胞對(duì)M．tb Ag的特異增殖反應(yīng)受到抑制。 6．在IL-2的協(xié)同下M．tb Ag可以特異地活化NK細(xì)胞。 NK細(xì)胞可以被M．tb Ag活化，活化的NK細(xì)胞調(diào)節(jié)γδT細(xì)胞對(duì)M．tb Ag的免疫反應(yīng)，這一過程是IL-2依賴的。 7．NK細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子和CD54／LFA-1的相互作用調(diào)節(jié)γδT細(xì)胞的功能。 M．tb Ag可以誘導(dǎo)NK細(xì)胞分泌IL-12、GM-CSF、TNF-α，但不表達(dá)IL-4、IL-10；IL-12、GM-CSF、TNF-α單獨(dú)或聯(lián)合作用可以促進(jìn)γδT細(xì)胞的增殖，但不能取代NK細(xì)胞來調(diào)節(jié)γδT細(xì)胞對(duì)M．tb Ag的應(yīng)答；IFN-γ不參與NK細(xì)胞對(duì)γδT細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用；Transwell實(shí)驗(yàn)表明，除了分泌細(xì)胞因子，NK細(xì)胞還可能通過細(xì)胞-細(xì)胞間接觸的方式調(diào)節(jié)γδT細(xì)胞對(duì)M．tb Ag的特異性增殖反應(yīng)；FACS、激光共聚焦顯微鏡和抑制實(shí)驗(yàn)證實(shí)NK細(xì)胞通過其表面的CD54分子和γδT細(xì)胞形成免疫突觸，調(diào)節(jié)γδT細(xì)胞對(duì)M．tb Ag的特異性增殖反應(yīng)。 結(jié)論 1．IL-15可以促進(jìn)臍血CD56~(bright)和CD56~(dim)NK細(xì)胞的增殖，并維持其長(zhǎng)期存活，不斷提高NK細(xì)胞IFN-γ的分泌能力和殺傷活性；而IL-2對(duì)臍血NK細(xì)胞只在早期表現(xiàn)促增殖作用，后期誘導(dǎo)CD56~(dim)NK細(xì)胞的凋亡，，導(dǎo)致NK細(xì)胞功能下降。 2．由于存在IL-2—IL-2Rα正反饋環(huán)路，IL-2對(duì)臍血T細(xì)胞的作用更強(qiáng)。 3．臍血NK細(xì)胞的表型與成人外周血明顯不同。臍血NK細(xì)胞可能是未成熟的細(xì)胞。 4．IL-2和IL-15對(duì)成人外周血NK細(xì)胞的促增殖作用無顯著性差異。 5．在IL-2的作用下，NK細(xì)胞可以被M．tb Ag活化，活化的NK細(xì)胞調(diào)節(jié)γδT細(xì)胞對(duì)M．tb Ag的免疫反應(yīng)。 6．NK細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子(主要是GM-CSF、TNF-α、IL-12)和細(xì)胞與細(xì)胞間接觸兩種方式調(diào)節(jié)γδT細(xì)胞對(duì)M．tb Ag的反應(yīng)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R392

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2326376