【摘要】： 干擾素誘導(dǎo)蛋白10(interferon inducible protein 10，IP-10)，是新近發(fā)現(xiàn)的CXC類重要的趨化因子家族成員。IP-10通過與其特異性受體CXCR3結(jié)合，在機(jī)體發(fā)揮重要的生物學(xué)功能，殺滅微生物、抗病毒、抗腫瘤、介導(dǎo)Th1型免疫反應(yīng)等。在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)引起的內(nèi)毒素休克中，LPS激活單核巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞合成和釋放各種細(xì)胞因子和黏附分子，其中IP-10作為一種重要的細(xì)胞因子其表達(dá)量異常的升高，且在內(nèi)毒素休克小鼠的肝臟、肺臟、腎臟中IP-10的表達(dá)量均顯著升高。IP-10通過趨化炎性細(xì)胞到達(dá)炎癥組織，在一定程度上發(fā)揮殺滅病原體的作用，但過強(qiáng)的免疫反應(yīng)又會(huì)對機(jī)體造成損害，引起全身炎癥反應(yīng)綜合征，嚴(yán)重者導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生多器官功能不全綜合征。 IP-10在機(jī)體多種組織和細(xì)胞中都有表達(dá)，包括單核巨噬細(xì)胞、活化的成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、各種淋巴細(xì)胞等三十多種細(xì)胞，且多種刺激均能上調(diào)或下調(diào)IP-10基因的表達(dá)，如干擾素γ(interferon-γ, IFN-γ)、干擾素α(interferon-α，IFN-α)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素4(interleukin，IL-4)、白介素12(interleukin，IL-12)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等。不同刺激在不同細(xì)胞、不同種系可能通過不同的信號(hào)通路誘導(dǎo)IP-10基因的表達(dá)，相關(guān)的調(diào)控機(jī)制也不盡相同。目前對鼠源性IP-10同源物細(xì)胞因子反應(yīng)性基因(cytokine responsive gene-2，crg-2)的信號(hào)通路已有一些研究，但對IP-10相關(guān)的調(diào)控機(jī)制及其在內(nèi)毒素休克模型中的表達(dá)機(jī)制則知之其少。 基因表達(dá)的調(diào)控是細(xì)胞對外部或內(nèi)部的刺激發(fā)生應(yīng)答的方式，這是一個(gè)高度復(fù)雜，精確調(diào)控的過程，基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控可以在復(fù)制、擴(kuò)增、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯和翻譯后多等級(jí)水平上進(jìn)行，但mRNA轉(zhuǎn)錄起始是基因表達(dá)調(diào)控的基本控制點(diǎn)，即在一定時(shí)間、空間特異性的基礎(chǔ)上，由特異基因的啟動(dòng)子與調(diào)節(jié)蛋白的相互作用來決定的。其實(shí)質(zhì)即DNA-蛋白質(zhì)／蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用對RNA聚合酶活性的影響。另外，人們發(fā)現(xiàn)，在基因調(diào)控過程中，往往不是單個(gè)因素起作用，而是多種調(diào)節(jié)因素相互交織，相互影響，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，最終使基因表達(dá)調(diào)控呈現(xiàn)出一種高度的有序性。鑒于這種廣泛的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與DNA相互作用網(wǎng)絡(luò)參與其中，相關(guān)研究策略也層出不窮。其中，啟動(dòng)子DNA結(jié)合蛋白的研究是從轉(zhuǎn)錄水平上研究基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，以尋找新的蛋白質(zhì)為手段，以了解其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用為目的，，從而最終為闡明某些疾病的發(fā)病機(jī)制及基因治療奠定基礎(chǔ)。目前，對啟動(dòng)子DNA結(jié)合蛋白的研究方法可分為兩大類：第一類是細(xì)胞內(nèi)法，以已知啟動(dòng)子DNA序列篩選出與其相結(jié)合的蛋白的編碼基因，通過生物信息分析來確定該蛋白質(zhì)；第二類是細(xì)胞外法，即在體外用重組的已知蛋白質(zhì)與啟動(dòng)子DNA結(jié)合。二者各有其自身的優(yōu)勢，但又都有各自的缺陷。我們以細(xì)胞外法為基礎(chǔ)，將以上二者結(jié)合應(yīng)用，以期達(dá)到既能找到未知調(diào)控蛋白，又能夠找到該蛋白質(zhì)的精確的結(jié)合位點(diǎn)并證實(shí)二者結(jié)合特異性的目的。 由此，我們從“組學(xué)”的角度和活體組織水平，根據(jù)DNA-蛋白質(zhì)相互作用的原理，基于生物素-鏈親和素系統(tǒng)、磁珠分離技術(shù)，結(jié)合生物質(zhì)譜技術(shù)篩選了內(nèi)毒素休克小鼠的肝臟組織中與IP-10啟動(dòng)子發(fā)生相互作用的結(jié)合蛋白，并對鑒定出的重要調(diào)控元件高遷移率族蛋白1(high mobility group box 1，HMGB1)進(jìn)行了進(jìn)一步的體外結(jié)合驗(yàn)證及對IP-10基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用等方面的深入研究。 利用末端生物素(biotin)標(biāo)記的IP-10啟動(dòng)子區(qū)引物，PCR擴(kuò)增制備IP-10啟動(dòng)子區(qū)探針(IP-10p-biotin)。制備內(nèi)毒素休克動(dòng)物模型(BALB／c小鼠)，提取肝臟組織胞核蛋白，與擴(kuò)增的IP-10p-biotin探針行結(jié)合反應(yīng)，再以標(biāo)記有鏈親和素(streptavidin)的磁珠分離IP-10p-biotin-蛋白反應(yīng)復(fù)合物，不同鹽濃度緩沖液洗脫結(jié)合的蛋白，使用聚丙稀酰胺凝膠電泳分離洗脫的樣品蛋白，并對凝膠行銀染顯色，比較內(nèi)毒素休克組與正常對照組的差異條帶(DNA pull-down assay)。結(jié)果表明，在肝臟組織胞核中，共有17個(gè)蛋白可能參與了內(nèi)毒素休克小鼠肝臟中IP-10的表達(dá)調(diào)控。其中14個(gè)蛋白在LPS作用后與IP-10啟動(dòng)子結(jié)合增加，提示這些蛋白在LPS作用后可能參與了IP-10的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，而另外3個(gè)蛋白則在LPS作用后，與正常對照組相比作用減弱或消失，且多次重復(fù)均得到相同的結(jié)果。 對結(jié)果中出現(xiàn)的17個(gè)差異條帶行切膠進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，根據(jù)得到的肽指紋圖譜，利用Mascot查詢軟件搜索NCBI數(shù)據(jù)庫，綜合分析后得到五個(gè)與轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)的蛋白分子，分別為高遷移率蛋白家族的高遷移率族蛋白1(high mobility group box 1，HMGBl)和高遷移率族蛋白2(high mobility group box 2，HMGB2)，組蛋白3(histone 3，H3)，乙酰輔酶A酰基轉(zhuǎn)移酶(acetyl-Coenzyme Aacyltransferase 2，ACAA2)及甲狀腺激素受體相關(guān)蛋白(thyroid hormone receptor associated proteins，TRAP)。其中，HMGB1、HMGB2最初發(fā)現(xiàn)其即作為核因子參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，它們主要通過修飾，彎曲或改變?nèi)旧|(zhì)／DNA的結(jié)構(gòu)，促進(jìn)各種蛋白因子形成大分子復(fù)合物來調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄；組蛋白H3作為染色體結(jié)構(gòu)中高度保守的一類核心組蛋白(core histone)，主要通過其乙�；降恼{(diào)節(jié)控制基因轉(zhuǎn)錄的“開”和“關(guān)”；乙酰輔酶A�；D(zhuǎn)移酶則通過對組蛋白、HMGB1、HMGB2的乙�；瘏⑴c基因調(diào)控；甲狀腺激素受體相關(guān)蛋白是新進(jìn)研究的轉(zhuǎn)錄協(xié)調(diào)因子的一類中介因子，它主要通過與轉(zhuǎn)錄激活因子、RNA聚合酶Ⅱ及基本轉(zhuǎn)錄因子(general transcription factors，GTFs)相互接觸從而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的裝配。質(zhì)譜鑒定得到的這些結(jié)果充分說明內(nèi)毒素休克小鼠中IP-10基因的表達(dá)調(diào)控可能受到了多種因素的影響，這些因素相互協(xié)調(diào)，共同作用從而影響IP-10基因的表達(dá)調(diào)控。 鑒于HMGB1在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的重要作用，我們將其作為IP-10基因調(diào)控中的重要因子對其進(jìn)行了多方面的驗(yàn)證，主要包括體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞免疫熒光和Western blotting分析體外IP-10與HMGB1的結(jié)合活性、內(nèi)源性的HMGB1的定位及其表達(dá)情況。首先，表達(dá)純化出帶組氨酸(His)標(biāo)簽的HMGBl融合蛋白，將其包被至耦合有鎳離子的熒光微球上，將其與末端帶biotin標(biāo)記的IP-10啟動(dòng)子全長以不同的摩爾比行體外結(jié)合反應(yīng)，加入耦聯(lián)有鏈霉親和素的熒光發(fā)光劑PE后，利用液相芯片系統(tǒng)(LiquiChip workstation)檢測各組DNA-蛋白的結(jié)合強(qiáng)度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HMGB1同IP-10啟動(dòng)子在體外有高親合力，且當(dāng)DNA：protein投入的摩爾比為2：1時(shí)，二者的結(jié)合趨于平臺(tái)期。這個(gè)結(jié)果同己知的HMGB1蛋白上存在兩個(gè)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(HMG box結(jié)構(gòu)域)相一致。 同時(shí)，我們用Western blot檢測內(nèi)毒素休克小鼠肝臟組織中HMGB1蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示在LPS刺激后胞核蛋白中HMGB1的表達(dá)量0.5 h開始增多，隨后恢復(fù)至正常，至3 h又有所增高，之后開始逐漸下降，同時(shí)總蛋白也有類似的變化趨勢。此外，在我們用培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞株SMMC7721細(xì)胞，檢測內(nèi)源性的HMGB1的定位試驗(yàn)中觀察到LPS刺激后早期，HMGB1特異的定位于細(xì)胞核內(nèi)，這樣的結(jié)果提示我們HMGB1作為核因子主要在基因表達(dá)的早期參與調(diào)控，而且我室早期的研究工作即表明，在LPS刺激的內(nèi)毒素休克小鼠肝臟組織中1 h即檢測到IP-10的升高，且在3 h達(dá)到高峰，由此可以初步推斷HMGB1在IP-10基因表達(dá)調(diào)控過程中，主要應(yīng)該發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平的改變，即早期使HMGB1的表達(dá)增加，從而參與調(diào)控早期IP-10基因的上調(diào)。 通過以上研究，我們得出以下結(jié)論：一：利用生物素-鏈親和素、磁珠分離技術(shù)成功篩選到參與IP-10基因調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子，在胞核蛋白中至少有17個(gè)蛋白可能參與了這一過程，并利用生物質(zhì)譜技術(shù)鑒定相關(guān)蛋白為HMG家族的HMGB1與HMGB2，組蛋白H3，乙�；D(zhuǎn)移酶，甲狀腺激素受體相關(guān)蛋白；二：在原核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)純化出帶His標(biāo)記的HMGB1蛋白，并與末端帶biotin標(biāo)記的IP-10啟動(dòng)子全長以不同的摩爾比體外結(jié)合，利用Liquichip液相芯片分析系統(tǒng)在體外驗(yàn)證了二者的相互作用，在DNA：protein為2：1時(shí)，二者的結(jié)合趨于平臺(tái)。三：細(xì)胞免疫熒光、Western blot結(jié)果表明，在LPS刺激的小鼠肝臟組織胞核蛋白中，早期HMGB1的表達(dá)即明顯升高，且細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)也在核內(nèi)檢測到HMGB1的表達(dá)，提示HMGB1對IP-10的表達(dá)調(diào)控作用主要發(fā)生在內(nèi)毒素休克的早期，從而發(fā)揮IP-10在內(nèi)毒素休克早期對機(jī)體的保護(hù)作用。 本研究利用DNA-蛋白質(zhì)相互作用的原理，為從“轉(zhuǎn)錄調(diào)控組學(xué)”的角度分析基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控過程及其機(jī)制開創(chuàng)了新的思路。同時(shí)差異條帶的出現(xiàn)說明在內(nèi)毒素休克小鼠中IP-10的轉(zhuǎn)錄調(diào)控發(fā)生了較為復(fù)雜的變化，可能有多種核蛋白或轉(zhuǎn)錄因子參與了這一過程。這些蛋白的鑒定對于我們深入理解IP-10基因表達(dá)調(diào)控有重要的意義，同時(shí)也將為臨床治療內(nèi)毒素休克提供新的理論依據(jù)及可能的治療靶點(diǎn)。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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1 姜勇;LPS介導(dǎo)細(xì)胞激活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo):從CD14到p38MAPK通路的研究[J];生理科學(xué)進(jìn)展;1999年01期

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本文編號(hào)：2315508