【摘要】： 心肌梗死是一種嚴(yán)重威脅人類生命健康的疾病，溶栓治療是臨床急救心肌梗死的一種常用手段。葡激酶(Staphylokinase，SAK)具有與組織型纖溶酶原激活劑(Recombinant tissue-type plasminogen activator，t-PA)相當(dāng)?shù)娜芩ɑ钚�，并有更高的纖維蛋白專一性，能以大腸桿菌為宿主大量制備，是一種很有應(yīng)用前景的溶栓劑。但SAK仍存在著再通不完全、初始再灌注延遲、血栓再形成、出血和過敏反應(yīng)等缺陷，限制了臨床使用。血小板聚集在動脈血栓形成中起重要作用，，而血小板聚集依賴于特有的功能性受體GPⅡb／Ⅲa，Arg-Gly-Asp(RGD)三肽序列能特異性結(jié)合GPⅡb／Ⅲa，從而抑制血小板聚集。因此，本實(shí)驗(yàn)室利用定點(diǎn)突變PCR技術(shù)，將SAK第35位賴氨酸(K)置換為精氨酸(R)，設(shè)計(jì)了新型SAK突變體RGD-SAK，通過5L發(fā)酵罐小試發(fā)酵、純化得到重組RGD-SAK純品蛋白，初步生物學(xué)試驗(yàn)證實(shí)其具有溶栓和抑制血小板聚集的雙重功能。 在上述研究基礎(chǔ)上，本課題進(jìn)行了RGD-SAK的中試和臨床前研究。包括建立300L發(fā)酵罐RGD-SAK工程菌大規(guī)模發(fā)酵和表達(dá)產(chǎn)物純化工藝，并完成中試產(chǎn)品的質(zhì)量檢定和質(zhì)量控制，為臨床前研究提供足量樣品；根據(jù)國家生物制品規(guī)程制定制造和檢定規(guī)程；體外檢測RGD-SAK功能；開展臨床前藥效學(xué)研究，包括：RGD-SAK溶栓、防栓及預(yù)防再狹窄等功效；研究RGD-SAK的藥代動力學(xué)特征并進(jìn)行安全性評價，為臨床試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。 中試階段利用300L發(fā)酵罐進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵，42℃誘導(dǎo)基因表達(dá)，誘導(dǎo)后0.5小時開始胞內(nèi)可溶性表達(dá)活性RGD-SAK，2.5小時達(dá)到表達(dá)高峰，表達(dá)產(chǎn)物約占菌體總蛋白的60％。高壓破菌后胞液通過陽離子交換層析柱(SP-Sepharose)，凝膠過濾層析柱(Sephadex G-50)和陰離子交換層析柱(Q-Sepharose)后，得到高純度的產(chǎn)品。RP-HPLC分析純度＞98％，LC-MS分析產(chǎn)品分子量為15，478D，每升發(fā)酵液得RGD-SAK純品300mg，純化得率達(dá)60％。進(jìn)一步的質(zhì)量檢定表明各項(xiàng)檢測指標(biāo)均符合國家生物制品檢定標(biāo)準(zhǔn)。 RGD-SAK N端序列及一級結(jié)構(gòu)序列測定結(jié)果和原設(shè)計(jì)一致，其溶栓比活性為12，000IU／mg，體外對激活血小板有較高的結(jié)合力(P＜0.05)，并呈量效關(guān)系，而SAK無此功能，相對于SAK，RGD-SAK體外溶解血小板血栓所需時間明顯縮短(P＜0.05)。RGD-SAK體外能抑制血小板聚集且呈量效關(guān)系，SAK無此功能。上述結(jié)果提示RGD-SAK在體內(nèi)可能通過靶向結(jié)合血小板提高溶栓效率，并通過抑制血小板聚集而降低溶栓后再栓。 利用球囊損傷形成血栓模型，開展了RGD-SAK溶栓及溶栓后預(yù)防再栓的藥效學(xué)研究，利用DSA(digital substrate angiography)造影觀察冠狀動脈損傷前、血栓形成時、溶栓90分鐘、24小時及30天血管通暢情況，并進(jìn)行血液學(xué)分析，結(jié)果顯示，RGD-SAK 50，000 IU／kg較等劑量SAK有更高的90分鐘溶栓開通率(P＜0.05)，RGD-SAK 30，000 IU／kg 90分鐘溶栓率不低于SAK50，000 IU／kg組(P＞0.05)，同時，溶栓后30天DSA造影結(jié)果顯示，RGD-SAK30，000及50，000 IU／kg組中均未發(fā)現(xiàn)再梗塞，而SAK 50，000 IU／kg組中6只溶栓再通的豬中有4只發(fā)生再梗塞(P＜0.05)。檢測血液中反應(yīng)溶栓指標(biāo)D-dimer和cTnT(心肌鈣結(jié)合蛋白T，cardiac troponin T)發(fā)現(xiàn)，RGD-SAK50，000 IU／kg溶栓后90分鐘及24小時后兩者均高于SAK 50，000 IU／kg組；檢測和動脈血栓形成相關(guān)指標(biāo)血小板聚集率發(fā)現(xiàn)，各劑量RGD-SAK組均明顯拮抗血小板聚集(P＜0.05)，而SAK 50，000 IU／kg拮抗血小板聚集作用不明顯；檢測血液中凝血酶原時間(Prothrombin Time，PT)，活化部分凝血活酶時間(Activated Partial Thromboplastin Time，APTT、，凝血酶時間(Thrombin Time，TT)及纖維蛋白原(Fibrinogen，F(xiàn)g)的水平發(fā)現(xiàn)，各組上述指標(biāo)在觀察時間內(nèi)均無顯著變化，這表明在實(shí)驗(yàn)濃度范圍中RGD-SAK和SAK對系統(tǒng)凝血和纖溶系統(tǒng)無明顯影響(P＞0.05)。上述結(jié)果表明，該模型中50，000 IU／kg RGD-SAK較等量SAK具有更高的溶栓效率，并可以預(yù)防溶栓后再栓，同時不影響系統(tǒng)的凝血和纖溶功能。 再狹窄是經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)血管成形術(shù)(Percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA)的常見并發(fā)癥，為探索RGD-SAK是否具有預(yù)防再狹窄的功效，利用球囊損傷豬冠狀動脈建立了再狹窄模型，病理切片觀察損傷30天后冠狀動脈內(nèi)膜增生程度，并檢測試驗(yàn)血管組織中超氧陰離子(·O~(2-))濃度和NADPH氧化酶的活性，western blot分析NADPH氧化酶亞基p22~(phox)和gp91~(phox)的表達(dá)情況，同時檢測血液中血小板誘導(dǎo)生長因子-BB(Platelet derived growth factor，PDGF-BB)濃度，結(jié)果表明，球囊損傷30天后，損傷部位明顯出現(xiàn)內(nèi)膜增生形成再狹窄，增生細(xì)胞主要為平滑肌細(xì)胞，相對于SAK50，000 IU／kg，等劑量RGD-SAK能明顯抑制損傷后內(nèi)膜增生(P＜0.05)，并能減少血液中PDGF-BB的釋放，同時能明顯抑制NADPH氧化酶依賴性的·O~(2-)濃度增高(P＜0.05)，進(jìn)一步試驗(yàn)表明RGD-SAK 50，000 IU／kg組能夠顯著抑制損傷引起的NADPH氧化酶亞基p22~(phox)和gp91~(phox)表達(dá)增加，上述結(jié)果說明RGD-SAK可能通過抑制血小板聚集、活化減少PDGF-BB的釋放，從而抑制損傷引起的NADPH氧化酶亞基p22~(phox) and gp91~(phox)的高表達(dá)，降低血管產(chǎn)生·O~(2-)，有利于預(yù)防血管損傷后再狹窄的產(chǎn)生。 采用~(125)I放射性示蹤技術(shù)，對RGD-SAK在SD大鼠體內(nèi)進(jìn)行藥代動力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，低(0.5m／kg)、中(1mg／kg)、高(2mg／kg)三種劑量RGD-SAK的t_(1/2(β))分別為51.77±11.78min、55.03±8.64min及54.82±8.11min，在所用劑量范圍內(nèi)(0.5-2mg／kg)其動力學(xué)特性符合線性動力學(xué)過程，腎臟是RGD-SAK的主要體內(nèi)排泄途徑。 進(jìn)一步對RGD-SAK進(jìn)行了較為系統(tǒng)的安全性評價。急性毒性最大耐受量試驗(yàn)結(jié)果表明，單次皮下注射給予250mg／kg體重最大耐受劑量后14天未見小鼠死亡，體重增長正常，證實(shí)本品急性毒性低；恒河猴長期毒性試驗(yàn)證實(shí)RGD-SAK低(1.5mg／kg)、中劑量(7.5 mg／kg)對恒河猴無明顯毒性作用，高劑量(15mg／kg)RGD-SAK主要毒性反應(yīng)靶器官為凝血系統(tǒng)和腎臟，本試驗(yàn)表明RGD-SAK對猴靜脈和皮下注射長期毒性劑量為15mg／kg (臨床用量50倍)，安全劑量為7.5 mg／kg (臨床用量25倍)，無毒性作用劑量為1.5 mg／kg (臨床用量5倍)；溶血試驗(yàn)結(jié)果表明，RGD-SAK對紅細(xì)胞無溶血或粘集反應(yīng)；鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變試驗(yàn)和哺乳動物體外細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)結(jié)果表明RGD-SAK無致突變和致畸作用。上述結(jié)果說明，RGD-SAK符合進(jìn)一步深入開展臨床試驗(yàn)的安全毒理學(xué)要求。 通過該課題研究，建立了較為成熟的中試生產(chǎn)工藝，為進(jìn)一步深入研究和大規(guī)模生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，RGD-SAK具有高效溶栓和防栓的作用，同時具有預(yù)防血管再狹窄的形成。RGD-SAK臨床前藥效學(xué)、藥代動力學(xué)和安全性評價的完成為進(jìn)一步開展RGD-SAK臨床研究打下了基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R341

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