【摘要】： 前言 腎綜合征出血熱(HFRS)是由布尼亞病毒科漢坦病毒屬(Hantavirus)的病毒引起的一種高病死率的傳染病。我國(guó)是受其危害最嚴(yán)重的國(guó)家，大約90％的病例發(fā)生在我國(guó)，由于其臨床表現(xiàn)復(fù)雜，并發(fā)癥多，尚無特效治療方法，其病死率可達(dá)5％。目前，漢坦病毒的檢測(cè)方法還存在許多缺陷，不能為臨床治療提供及時(shí)可靠的早期診斷依據(jù)，因而，常常錯(cuò)過最佳治療時(shí)機(jī)。HFRS致病機(jī)理的研究更是進(jìn)展緩慢，HFRS致病機(jī)理還不清楚。因此，研究漢坦病毒的檢測(cè)和HFRS的治療與致病機(jī)理具有重要的實(shí)際意義。 應(yīng)用噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)可篩選出人源抗?jié)h坦病毒抗原抗體，經(jīng)載體表達(dá)出可溶性scFv�？扇苄詓cFv具有穿透力強(qiáng)、容易到達(dá)靶細(xì)胞等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于漢坦病毒的檢測(cè)及HFRS的治療和致病機(jī)理研究。因此，為表達(dá)可溶性抗NP抗原scFv，并初步用于診斷漢坦病毒感染，本研究擬將提取的腎綜合征出血熱患者外周血淋巴細(xì)胞總RNA，擴(kuò)增V_H和V_L抗體基因，并合成scFv基因，與T7噬菌體載體連接，構(gòu)建T7噬菌體抗體庫(kù)，用漢坦病毒76-118核衣殼蛋白(NP)抗原篩選出特異性噬菌體抗體。并從陽(yáng)性克隆中擴(kuò)增出scFv基因，克隆入表達(dá)載體pGEX-6p-1，表達(dá)出可溶性scFv，再初步應(yīng)用可溶性單鏈抗體制備雙單鏈抗體夾心試劑，檢測(cè)血清中漢坦病毒NP抗原，建立敏感特異的腎綜合征出血熱診斷方法。 實(shí)驗(yàn)方法 一、scFv抗體基因的合成 應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離液常規(guī)分離HFRS恢復(fù)期患者外周血淋巴細(xì)胞，用RNAout提取總RNA。以總RNA為模板，以oligo(dT)為引物，反轉(zhuǎn)錄合成V_H基因和V_L基因的cDNA第一條鏈。 設(shè)計(jì)并合成V_H基因和V_L基因兩端簡(jiǎn)并引物，并在V_H基因5’端引物引入EcoRⅠ，在V_L基因引物3’端引入HindⅢ酶切位點(diǎn)。PCR合成V_H基因和V_L基因，以V_H基因和V_L基因?yàn)槟０�，SOE PCR拼接scFv抗體基因。 二、T7噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建 回收SOE PCR擴(kuò)增scFv基因，用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切scFv基因，電泳后凝膠回收雙酶切scFv基因與已用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切的T7 Select10-3b噬菌體載體的2個(gè)臂，經(jīng)T_4DNA連接酶連接。用T7噬菌體包裝提取物包裝連接反應(yīng)產(chǎn)物，鋪板測(cè)定包裝效率和scFv基因插入率。接種宿主菌BLT5403，增殖重組T7噬菌體，鋪板測(cè)定抗體庫(kù)的滴度。 三、T7噬菌體抗體庫(kù)的篩選 以重組漢坦病毒76-118 NP抗原包被酶標(biāo)板，BSA封閉，加入T7噬菌體抗體庫(kù)，室溫孵育30 min，TBST洗滌5次，1％SDS洗脫抗體庫(kù)，所得噬菌體抗體即為次級(jí)噬菌體抗體庫(kù)，感染宿主菌BLT5403擴(kuò)增后，可用于下一輪篩選。滴定次級(jí)噬菌體抗體庫(kù)的滴度，并計(jì)算每一輪篩選噬菌體投入／產(chǎn)出比(回收率)作為特異性噬菌體抗體富集的指標(biāo)，重復(fù)上述步驟4次。 四、酶免疫實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抗體活性 將上述篩選所得的抗體庫(kù)鋪板，隨機(jī)選取噬菌斑，在BLT5403內(nèi)擴(kuò)增，以NaCl和PEG 8000純化噬菌體抗體。用1％戊二醛偶聯(lián)噬菌體抗體和辣根過氧化物酶(HRP)，加過量10％甘氨酸封閉未反應(yīng)的戊二醛。同時(shí)，將野生噬菌體與辣根過氧化物酶偶聯(lián)，作為陰性對(duì)照。將酶偶聯(lián)噬菌體抗體和陰性對(duì)照，分別加入漢坦病毒G_1、G_2包膜蛋白和NP抗原包被的酶標(biāo)板，37℃孵育1h，TBST洗滌5次，加鄰苯二胺和H_2O_2底物，37℃作用15min，2M H_2SO_4終止反應(yīng)，在492nm波長(zhǎng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值，樣品A_(492)／陰性對(duì)照A_(492)＞2者，為陽(yáng)性。 五、pGEX-6P-1-scFv重組質(zhì)粒的構(gòu)建 選擇抗體活性最高T7噬菌體抗體在BLT5403中增殖，酚氯仿法提取T7 DNA，對(duì)T7噬菌體中scFv進(jìn)行測(cè)序。設(shè)計(jì)并合成scFv基因簡(jiǎn)并引物，并在其5’端和3’端引物中引入BamHⅠ和SalⅠ切酶位點(diǎn)。以提取的T7噬菌體DNA為模板，以合成的scFv簡(jiǎn)并引物為引物，PCR擴(kuò)增scFv基因�；厥誔CR擴(kuò)增的scFv基因，用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切scFv基因和pGEX-6p-1載體，電泳后凝膠回收雙酶切scFv基因和pGEX-6p-1載體大片段，16℃連接4小時(shí)，轉(zhuǎn)化E．coli BL-21(DE3)感受態(tài)菌。涂于Amp平板培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜。 六、重組質(zhì)粒的篩選及鑒定 挑取單個(gè)菌落，Amp LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，堿裂解法粗提質(zhì)粒，0.7％瓊脂糖凝膠電泳初篩陽(yáng)性質(zhì)粒，再用BamHⅠ和SalⅠ分別雙酶切及PCR擴(kuò)增法對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定并對(duì)scFv測(cè)序。 七、scFv融合蛋白的表達(dá)和純化及SDS-PAGE檢測(cè)和酶免疫檢測(cè) LB(含50μg／ml Amp)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)含有pGEX-6P-1-scFv質(zhì)粒的E．coliBL-21(DE3)菌株。加入IPTG至終濃度為1mM，誘導(dǎo)scFv融合蛋白表達(dá)。離心收集菌體，懸浮于PBS，超聲破碎。GST凝膠親和層析純化scFv融合蛋白。常規(guī)SDS-PAGE檢測(cè)scFv融合蛋白。 酶免疫鑒定可溶性單鏈抗體scFv生物活性，方法同四、。 八、酶標(biāo)抗體的制備和血清標(biāo)本檢測(cè) 1％戊二醛偶聯(lián)辣根過氧化物酶和純化的可溶性單鏈抗體，并用聚乙二醇濃縮。以可溶性抗NP單鏈抗體包被酶標(biāo)板，BSA封閉酶標(biāo)板。樣品血清每孔加樣50μl，37℃反應(yīng)1h，PBST洗滌5次，加酶標(biāo)抗體100μl，PBST洗滌5次。顯色及結(jié)果判斷同步驟四、。 結(jié)果 一、scFv抗體基因的合成 用淋巴細(xì)胞分離液共分離得到1.5×10~7腎綜合征出血熱恢復(fù)期患者外周血淋巴細(xì)胞。RNAout提取總RNA，電泳后呈明顯的3條帶，即28 S RNA，18 S RNA和5 S RNA，A_(260)nm／A_(280)nm的比值為1.8，說明提取的總RNA完整且純度好。RT-PCR擴(kuò)增V_H基因和V_L基因，兩者分子大小約為400bp，與理論估計(jì)值大小一致，用SOE PCR將V_H基因和V_L基因連接成scFv基因，分子大小約為750bp，與理論估計(jì)值大小一致。 二、T7噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建 噬菌體抗體庫(kù)構(gòu)建后，測(cè)定DNA包裝效率為1.5×10~7／μg DNA。測(cè)定scFv基因的插入率為90％，其庫(kù)容為1.35×10~7。初級(jí)噬菌體抗體庫(kù)滴度為2.12×10~(10)PFU／mL。 三、T7噬菌體抗體庫(kù)的篩選 用NP抗原對(duì)噬菌體抗庫(kù)進(jìn)行4輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”的篩選，噬菌體抗體得到約60倍的富集。 四、酶免疫實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抗體活性 隨機(jī)挑取第4輪篩選產(chǎn)物23個(gè)克隆，與辣根過氧化物酶偶聯(lián)，與用漢坦病毒G_1、G_2包膜蛋白和NP抗原包被的酶標(biāo)板特異性反應(yīng)。酶免疫結(jié)果顯示，19株具有抗原特異性結(jié)合活性，其中有2株具有較高的NP抗原特異性結(jié)合活性。 五、pGEX-6P-1-scFv重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將親和力最高的T7噬菌體抗體，在BLT5403中增殖。提取T7噬菌體DNA，干燥后溶于TE，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，可見36 kbT7 DNA噬菌體。測(cè)序證實(shí)獲得scFv序列。以T7噬菌體DNA為模板，PCR擴(kuò)增scFv基因，經(jīng)0.7％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)為750bp，與預(yù)期的scFv片段大小相同。 六、重組質(zhì)粒的篩選及鑒定 堿裂解法粗提質(zhì)粒，0.7％瓊脂糖凝膠電泳初篩陽(yáng)性質(zhì)粒，陽(yáng)性質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ雙酶切后，成5.0kb和750bp兩條明顯條帶，酶切鑒定結(jié)果表明成功構(gòu)建了pGEX-6P-1-scFv重組質(zhì)粒。同時(shí)通過PCR擴(kuò)增方法對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行了鑒定，獲得了750bp擴(kuò)增產(chǎn)物，證實(shí)獲得了含scFv基因片段的重組質(zhì)粒。測(cè)序結(jié)果顯示，質(zhì)粒中scFv與T7噬菌體相同。 七、scFv融合蛋白的表達(dá)和純化及SDS-PAGE檢測(cè)和酶免疫檢測(cè) 將含有pGEX-6P-1-scFv質(zhì)粒的E．coliBL-21(DE3)菌株培養(yǎng)，加入IPTG誘導(dǎo)，誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，超聲破碎菌體，GST凝膠于層析柱純化單鏈抗體融合蛋白。10％SDS-PAGE凝膠電泳，檢測(cè)到純化的融合scFv分子量大小為56KDa，與預(yù)期的結(jié)果相同，酶免疫檢測(cè)具有NP抗原結(jié)合功能。 八、酶標(biāo)抗體的制備和血清標(biāo)本檢測(cè) 以1％戊二醛溶液偶聯(lián)純化的可溶性scFv和HRP，聚乙二醇濃縮酶標(biāo)記抗體至1 ml。雙單鏈抗體夾心法檢測(cè)56份HFRS患者血清中，檢測(cè)出29例陽(yáng)性，陽(yáng)性率為51.79％，對(duì)照組66例，檢測(cè)結(jié)果均為陰性。 討論 本研究所構(gòu)建噬菌體抗體庫(kù)庫(kù)容為1.35×10~7，scFv基因的插入率為90％，測(cè)定DNA包裝效率為1.5×10~7／μg DNA，初級(jí)噬菌體抗體庫(kù)的滴度為2.12×10~(10)PFU／mL，經(jīng)過4輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”的篩選噬菌體得到約60倍的富集，酶免疫實(shí)驗(yàn)顯示有2株具有較高的NP抗原特異性結(jié)合活性。這些數(shù)據(jù)與國(guó)內(nèi)姚龍泉等學(xué)者所建文庫(kù)非常相似。 T7噬菌體優(yōu)點(diǎn)是所展示的蛋白質(zhì)的分子量很大，其最大展示蛋白的分子為1200氨基酸，這是M13噬菌體無法達(dá)到的。T7噬菌體的另一大優(yōu)點(diǎn)是它極為穩(wěn)定，能在各種嚴(yán)酷的條件下不被破壞，，而其它噬菌體常在親和淘洗過程中失活。此外，T7生長(zhǎng)極為迅速，T7噬菌體形成噬斑僅需3小時(shí)，這可以大大縮短研究周期。 在引物設(shè)計(jì)方面，設(shè)計(jì)一對(duì)V_H簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增出大部分V_H基因，設(shè)計(jì)一對(duì)V_L簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增出大部分V_L基因，既最大限度地?cái)U(kuò)增出了多樣的抗體基因，又減少了引物的使用，簡(jiǎn)化了操作，節(jié)約了時(shí)間。同時(shí)在V_H的羧基端基因和V_L的氨基端基因引入編碼連接肽(Gly_4Ser)_3序列，通過SOE PCR法直接將V_H基因和V_L基因拼接成V_H-(Gly_4Ser)_3-V_L形式的scF_v，這樣大大簡(jiǎn)化了基因重組過程。 目前大多數(shù)研究只是從噬菌體庫(kù)中篩選出相映抗體。而本研究進(jìn)一步將scFv基因克隆到pGEX-6P-1上，表達(dá)出可以最終應(yīng)用的可溶性單鏈抗體。融合scFv分子量約為56Kda，包括30Kda單鏈抗體和26Kda載體蛋白，載體蛋白一般不影響單鏈抗體的功能，而且載體蛋白有利于蛋白純化，必要時(shí)可以被蛋白酶完全切掉。 雙單鏈抗體夾心法，與傳統(tǒng)的雙抗體夾心法相比其最大優(yōu)勢(shì)之一是其造價(jià)低廉。通過基因工程技術(shù)，在大腸桿菌中生產(chǎn)出單鏈抗體比通過雜交瘤技術(shù)在培養(yǎng)細(xì)胞中生產(chǎn)的單克隆抗體更節(jié)約時(shí)間且成本低廉，還容易操作。 雙單鏈抗體夾心法檢測(cè)56份患者血清和對(duì)66例對(duì)照，在56份HFRS患者血清中，檢測(cè)出29例陽(yáng)性，陽(yáng)性率為51.79％，在對(duì)照組中為檢測(cè)結(jié)果均為陰性。目前認(rèn)為，病程早期以病毒血癥為主，在腎綜合征出血熱的病程晚期，機(jī)體免疫功能發(fā)揮作用，病毒逐漸被清除，不易在患者血清中檢出病毒抗原。由此推測(cè)，本研究中25例未檢出NP抗原標(biāo)本可能在病程晚期。 結(jié)論 本研究運(yùn)用噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)構(gòu)建了人源單鏈T7噬菌體抗體庫(kù)，庫(kù)容量為1.35×10~7，初級(jí)噬菌體抗體庫(kù)的滴度為2.12×10~(10)PFU／mL。經(jīng)酶免疫實(shí)驗(yàn)篩選到2株具有較高的與NP抗原特異性結(jié)合活性噬菌體抗體。研究中成功構(gòu)建了融合蛋白表達(dá)載體pOEX-6P-1-scFv，獲得了高效表達(dá)的可溶性scFv，酶免疫實(shí)驗(yàn)顯示，可溶性scFv具有較高的NP抗原特異性結(jié)合活性。首次用大腸桿菌表達(dá)的抗NP單鏈抗體，成功制備了雙單鏈抗體夾心診斷試劑，成功用于診斷漢坦病毒感染。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2306991