【摘要】： 結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteria tuberculosis, M. tuberculosis)是引起結(jié)核病的病原體。目前由于該病原體和HIV的協(xié)同作用以及多重耐藥菌株的出現(xiàn),使曾被有效控制的結(jié)核病的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢,因此,目前尋找新一代的、能有效對抗這種病原體的藥物已成為試圖控制這種疾病蔓延研究的中心。 細胞壁是分枝桿菌賴以生存的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),其核心結(jié)構(gòu)mAGP (mycolic acid, arabinogalactan, peptidoglycan)由分枝菌酸、聚阿拉伯糖半乳糖及肽聚糖三種成分組成,其中分枝菌酸和聚阿拉伯糖半乳糖(arabinogalactan, AG)通過二糖連接分子(L-鼠李糖-D-N-乙酰葡萄糖胺)共價連接到肽聚糖大分子上。在肽聚糖和二糖連接分子中共有的組成成分是N-乙酰葡萄糖胺,影響它合成的因素都是尋找藥物理想的靶向分子。 N-乙酰葡萄糖胺合成過程是一系列的酶促反應(yīng)過程,其中g(shù)lmU (Rv1018)是一種雙功能酶,在其中催化了兩步連續(xù)的反應(yīng),其一為催化1-磷酸-葡萄糖胺生成1-磷酸-N-乙酰葡萄糖胺;其二為催化1-磷酸-N-乙酰葡萄糖胺生成終產(chǎn)物UDP-N-乙酰葡萄糖胺。 本課題利用與結(jié)核分枝桿菌有相同細胞壁結(jié)構(gòu),但生長快速且無致病性的恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis,Sm) mc~2155菌株作為實驗?zāi)Ｐ?以glmU基因作為研究對象,并采用基于同源重組的插入突變方法使glmU基因發(fā)生突變。目的是用基因敲除的方法證明結(jié)核分枝桿菌中g(shù)lmU基因是分枝桿菌生長過程中所必需的基因,并對glmU基因敲除菌株進行了一系列的表型變化觀察及細胞壁結(jié)構(gòu)的聚糖組成成分分析,從而證明glmU基因在分枝桿菌生長過程中具有重要作用,這將為其作為研發(fā)抗結(jié)核新藥的靶標提供有力的證據(jù)。 本論文獲得以下結(jié)果: 1. Sm glmU基因的擴增和克隆 從TIGR基因數(shù)據(jù)庫(http://www.tigr.org/tdb/)獲得M. smegmatis mc~2155菌株的glmU基因的核苷酸序列。根據(jù)Sm glmU基因的核苷酸序列設(shè)計引物,用高保真LA Taq DNA聚合酶從mc~2155基因組中擴增Sm glmU基因及其上游約500 bp的DNA序列,并將其克隆到pMD18-T的克隆質(zhì)粒上,用BcaBEST測序引物和M13引物對Sm glmU基因的兩端進行DNA序列測定,將測序結(jié)果與已知的Sm glmU基因進行相似性比較,得到與mc~2155基因組上Sm glmU基因序列完全一致的克隆質(zhì)粒。 2.條件性復(fù)制質(zhì)粒pPR27-xylE-Sm glmU::KanR的構(gòu)建 將來自于質(zhì)粒pUC4K的KanR克隆到Sm glmU基因內(nèi)部,產(chǎn)生Sm glmU::KanR突變基因。將Sm glmU::KanR突變基因克隆到pPR27-xylE質(zhì)粒,構(gòu)建出條件性復(fù)制質(zhì)粒pPR27-xylE-Sm glmU::KanR。pPR27攜帶溫度敏感型復(fù)制子,該質(zhì)粒在30°C條件下可以復(fù)制,在42°C條件下不能復(fù)制。pPR27攜帶的sacB基因為負選擇標記,該基因表達產(chǎn)物蔗糖6-果糖基轉(zhuǎn)移酶(Levansucrase)能夠分解蔗糖,產(chǎn)生對細菌生長有害的聚果糖,使細菌死亡。xylE基因產(chǎn)物是兒茶酚2, 3-氧化還原酶,它能氧化兒茶酚成黃色的化合物,使菌落呈現(xiàn)金黃色。 3.營救質(zhì)粒的構(gòu)建 營救質(zhì)粒攜帶正常的M. tuberculosis glmU基因,其作用是在mc~2155 glmU基因敲除菌株中補償突變的glmU基因的功能。本實驗用高保真LA Taq DNA聚合酶分別從M. tuberculosis H37Rv菌株基因組中擴增Tb glmU基因,構(gòu)建營救質(zhì)粒pCG76-Phsp60-Tb glmU。pCG76為分枝桿菌表達質(zhì)粒,pCG76攜帶溫度敏感型復(fù)制子,即該質(zhì)粒在30°C條件下可以復(fù)制,在42°C條件下不能復(fù)制。Tb glmU基因的表達受來源于分枝桿菌BCG熱休克蛋白60的啟動子Phsp60控制。pCG76-Phsp60-Tb glmU營救質(zhì)粒用于證明Tb glmU是否為分枝桿菌生長相關(guān)基因。 4.第一次同源重組突變菌株mc~2155 glmU SCO-1的篩選 將條件復(fù)制性質(zhì)粒pPR27-xylE-Sm glmU::KanR電轉(zhuǎn)化到mc~2155感受態(tài)細胞中。依據(jù)pPR27-xylE-Sm glmU::KanR質(zhì)粒在30°C時能復(fù)制,在42°C時不能復(fù)制,在42°C條件下培養(yǎng)攜帶pPR27-xylE-Sm glmU::KanR質(zhì)粒的mc~2155,迫使pPR27-xylE-Sm glmU::KanR質(zhì)粒的Sm glmU::KanR與mc~2155基因組中的Sm glmU發(fā)生同源重組,使Sm glmU::KanR以及sacB基因、xylE基因整合到mc~2155基因組中。用地高辛標記的Sm glmU探針(DIG-Sm glmU)對經(jīng)過SmaI酶切的第一次重組菌落的基因組DNA進行Southern雜交分析,當結(jié)果中出現(xiàn)預(yù)期的雜交條帶為發(fā)生第一次同源重組的突變菌株mc~2155 glmU SCO-1 (the first single crossover)。 5.第二次同源重組突變菌株mc~2155 glmU SCO-2 (glmU基因敲除)的篩選 將攜帶Tb glmU基因的營救質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到mc~2155 glmU SCO-1感受態(tài)細胞中,在30°C條件下,在含10 %蔗糖的選擇性LB瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的mc~2155 glmU SCO-1,由于pPR27-xylE-Sm glmU::KanR的sacB基因和xylE基因也被整合到mc~2155 glmU SCO-1基因組中,sacB基因的表達產(chǎn)物蔗糖6-果糖基轉(zhuǎn)移酶能水解蔗糖,產(chǎn)生引起mc~2155 glmU SCO-1致死的聚果糖,在這種選擇壓力下,mc~2155 glmU SCO-1基因組中的Sm glmU::KanR與Sm glmU發(fā)生第二次同源重組,將Sm glmU基因、scaB基因以及xylE基因從mc~2155 glmU SCO-1基因組中刪除并被核酸酶水解,基因組中只存在Sm glmU::KanR。營救質(zhì)�？梢栽趍c~2155 glmU KOT突變菌株中表達出Tb GlmU蛋白質(zhì),從而補償基因組上失活的Sm GlmU的生物學作用。同樣地,應(yīng)用Southern印跡方法篩選出mc~2155 glmU SCO-2 (the second single crossover),即Sm glmU基因敲除菌株mc~2155 glmU KOT (glmU knock out,基因敲除)。 6.生長曲線的測定 在30°C及42°C條件下,每間隔24小時測定mc~2155 glmU KOT突變菌株在600 nm處的光吸收值,并繪制生長曲線。生長曲線的結(jié)果表明,對照的野生型菌株即能在30°C條件下又能在42°C條件下生長;而突變菌株在30°C條件下能夠生長,而在42°C條件下卻失去生長能力。因而說明了結(jié)核分枝桿菌的glmU基因為分枝桿菌生長相關(guān)基因。 7.溫度轉(zhuǎn)換后生長曲線和菌落形成單位(CFU)曲線的繪制 mc~2155 glmU KOT菌株和野生型的mc~2155菌株在30°C條件下生長至OD600為0.09,然后轉(zhuǎn)變溫度為42°C后繼續(xù)生長,每隔24小時測定其在600 nm的吸光度值,并繪制生長曲線。溫度轉(zhuǎn)換后的生長曲線結(jié)果顯示,野生型的mc~2155菌株,溫度的轉(zhuǎn)換對其生長沒有明顯的影響;而mc~2155 glmU KOT菌株,在轉(zhuǎn)變溫度后的24小時之內(nèi),細菌會繼續(xù)生長,并達到吸光度值的最高值;然而繼續(xù)延長時間,細菌不再生長,其吸光度值持續(xù)下降。對mc~2155 glmU KOT菌株同時進行對可活菌落進行計數(shù)的菌落形成單位(colony forming unit, CFU)測定,結(jié)果表明mc~2155 glmU KOT菌株的吸光度值與CFU具有相同的趨勢,即都在轉(zhuǎn)變溫度后的24小時左右達到最高值,接下來持續(xù)下降。此結(jié)果進一步證實glmU基因為分枝菌酸生長所必需的基因,且mc~2155 glmU KOT菌株在溫度轉(zhuǎn)變后光吸收值的降低是由于細菌的死亡。 8.應(yīng)用顯微鏡技術(shù)對細胞形態(tài)的觀察 mc~2155 glmU KOT菌株的生長條件與CFU測定實驗中細菌的生長條件相同,收獲細菌后,應(yīng)用光學顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察其形態(tài)。光鏡的結(jié)果顯示,當細胞生長在30°C時細胞呈野生型細菌般的長棒狀;但當細胞的生長溫度轉(zhuǎn)變?yōu)?2°C后,雖然初始時細胞依然能維持棒狀,但細胞長度卻變的比野生型的細胞短很多;隨著在42°C生長時間的增加,細胞逐漸開始變?yōu)榍蛐?并且時間越長球形細胞所占的比例越大。掃描電子顯微鏡的結(jié)果則更清晰地顯示細胞形態(tài)的變化,當mc~2155 glmU KOT菌株生長在30°C時,細胞呈典型的棒狀;當在42°C生長一定時期后,細胞變短,并有球形趨勢產(chǎn)生;隨著在42°C生長時間的延長,細胞由短棒狀逐漸變?yōu)榍蛐?并且細菌細胞壁局部出現(xiàn)缺損,在胞外低滲透壓的影響下,細胞腫脹、裂解甚至死亡。因此活性GlmU缺陷導(dǎo)致細菌細胞壁合成障礙,從而對細胞的形態(tài)產(chǎn)生影響,并最終導(dǎo)致細胞裂解、死亡。 9.應(yīng)用氣相色譜對細胞壁糖組分的分析及應(yīng)用高效液相Dionex陰離子交換層析對阿拉伯糖組分分析 mc~2155 glmU KOT菌株生長在30°C至其吸光度值為0.09后,轉(zhuǎn)移到42°C生長3天,提取細菌細胞壁的核心組分-分枝菌酸-聚阿拉伯半乳糖-肽聚糖(mycolic acid, arabinogalactan, peptidoglycan, mAGP),然后應(yīng)用氣相色譜(Gas Chromatography, GC)分析mAGP中糖的組成成分。本實驗中以mc~2155 glmU KOT菌株生長在30°C的細菌作為對照。GC結(jié)果表明,在活性GlmU缺失的mc~2155 glmU KOT菌株的mAGP中,阿拉伯糖含量明顯增加,半乳糖含量略有增加但不明顯;對照菌株與mc~2155野生型菌株相比沒有顯著不同。 用堿裂解法移除mAGP中的分枝菌酸和肽聚糖,使之成為可溶性的聚阿拉伯半乳糖(arabinogalactan, AG)。采用來自纖維單胞菌(Cellumonas gelida)的阿拉伯糖內(nèi)切酶消化可溶性AG,并應(yīng)用Dionex陰離子交換層析柱分析被內(nèi)切酶消化的樣品,結(jié)果表明,mc~2155 glmU KOT菌株主要產(chǎn)生峰Ara2和Ara6;但也有明顯的Ara4峰產(chǎn)生。Ara4峰的存在,說明有結(jié)構(gòu)缺陷的AG,既LAM (lipoarabinomannan)樣AG生成。此外,在mc~2155 glmU KOT菌株內(nèi),當活性GlmU缺失時,Ara2/Ara6與Ara2/Ara4的峰面積比值減小,由此可說明反映了聚阿拉伯糖末端分支的Ara4和Ara6峰面積相對增大,表明了聚阿拉伯糖末端的分支有增多。 結(jié)論: 本研究以恥垢分枝桿菌mc~2155菌株作為實驗?zāi)Ｐ妥C明結(jié)核分枝桿菌Tb glmU基因的生長相關(guān)性。構(gòu)建了攜帶Sm glmU::KanR突變基因的條件性復(fù)制質(zhì)粒pPR27-xylE-Sm glmU::KanR,并將其轉(zhuǎn)化入mc~2155,用Southern印記方法篩選出發(fā)生第一次同源重組的mc~2155 glmU SCO-1菌株。 構(gòu)建了攜帶Tb glmU基因的營救質(zhì)粒,并用營救質(zhì)粒轉(zhuǎn)化mc~2155 SCO-1,當Tb glmU基因表達時,mc~2155 glmU SCO-1基因組中的Sm glmU::KanR突變基因與Sm glmU基因發(fā)生第二次同源重組,用Southern印記方法篩選出發(fā)生第二次同源重組的mc~2155 glmU KOT突變菌株,即Sm glmU基因敲除菌株。 mc~2155 glmU KOT在30°C和42°C條件下的生長曲線,證實了結(jié)核分枝桿菌glmU為分枝桿菌生長所必需的基因;同時溫度轉(zhuǎn)換后生長曲線和CFU曲線的結(jié)果也進一步印證了glmU基因在分枝桿菌內(nèi)的生長必要性。 通過顯微鏡技術(shù)對細胞形態(tài)的觀察表明,當活性GlmU不足時可導(dǎo)致細胞形態(tài)發(fā)生改變,由典型的長棒狀變短、變圓;當活性GlmU缺失時,能導(dǎo)致細胞壁局部缺損,由于滲透壓的影響而導(dǎo)致細胞腫脹變圓,并裂解死亡。 GC與Dionex的結(jié)果共同說明了在mc~2155 glmU KOT菌株的細胞壁內(nèi),當缺失活性GlmU時,半乳糖含量沒有明顯變化;而阿拉伯糖含量明顯增加,且其增加是來自于具有分支的阿拉伯糖末端的增多。由此推斷在活性GlmU缺失的mc~2155 glmU KOT菌株中,負責合成聚阿拉伯糖末端分支的阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶EmbA和EmbB的表達量降低或功能異常,因而造成mAGP中聚阿拉伯糖末端的改變。 本研究為N-乙酰葡萄糖胺作為研發(fā)抗結(jié)核新藥的理想靶標提供了有力的證據(jù);證實活性GlmU的缺失能抑制細菌的擴增,并且會導(dǎo)致細菌因缺乏活性GlmU而裂解、死亡。所獲得的Sm glmU基因敲除菌株可作為篩選GlmU抑制劑的細胞模型來篩選先導(dǎo)化合物,以便發(fā)現(xiàn)新一代的抗結(jié)核藥物。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R52;R378

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本文編號：2306566