【摘要】： 目的：構(gòu)建淋球菌外膜蛋白PⅠB原核表達(dá)載體pET30a／PⅠB和真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)／PⅠB，并分別在E.coli BL21和HeLa細(xì)胞中表達(dá)，為后續(xù)淋球菌PⅠB蛋白免疫學(xué)特性的研究、抗體的制備以及淋球菌核酸疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。 方法：通過PCR擴(kuò)增淋球菌MS11菌株外膜蛋白PⅠB編碼基因，構(gòu)建淋球菌pET30a／PⅠB原核表達(dá)載體，測序正確后在E.coli BL21中誘導(dǎo)表達(dá)，，用SDS-PAGE和Western blot初步鑒定。從已測序鑒定的重組菌pET30a／PⅠB／JM109中提取重組質(zhì)粒pET30a／PⅠB，酶切目的片段克隆至pcDNA3.1(-)真核表達(dá)載體中，構(gòu)建真核表達(dá)重組體pcDNA3.1(-)／PⅠB，脂質(zhì)體介導(dǎo)體外轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞，用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測其在真核細(xì)胞中的表達(dá)。 結(jié)果： 1．將PⅠB蛋白編碼基因克隆至原核表達(dá)載體pET30a(+)，酶切、PCR和測序鑒定結(jié)果表明，插入的序列與GenBank登陸的淋球菌MS11株P(guān)ⅠB蛋白的編碼基因序列完全相符。 2．將pET30a／PⅠB轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21后，用IPTG在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)淋球菌外膜蛋白PⅠB，SDS-PAGE和免疫印跡法證實(shí)重組質(zhì)粒pET30a／PⅠB在大腸桿菌BL21能夠成功表達(dá)PⅠB融合蛋白，表達(dá)的融合蛋白具有免疫反應(yīng)性。 3．將pcDNA3.1(-)／PⅠB通過脂質(zhì)體介導(dǎo)體外轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測到了PⅠB蛋白的表達(dá)。 結(jié)論： 1．成功擴(kuò)增淋球菌MS11菌株外膜蛋白PⅠB基因，構(gòu)建了pET30a／PⅠB原核表達(dá)載體，pET30a／PⅠB原核表達(dá)載體能在大腸桿菌BL21內(nèi)表達(dá)。 2．成功構(gòu)建了pcDNA3.1(-)／PⅠB真核表達(dá)載體，pcDNA3.1(-)／PⅠB真核表達(dá)載體能夠在HeLa細(xì)胞中表達(dá)。
[Abstract]:Objective: to construct prokaryotic expression vector pET30a/P 鈪

本文編號(hào)：2306095