【摘要】： 間隙連接通道(gap junctional channels)是相鄰細(xì)胞之間直接進(jìn)行小分子物質(zhì)(分子量＜1000 Da，例如，離子、代謝產(chǎn)物和信使分子等)交換的通道。生物體通過(guò)這種通道進(jìn)行物質(zhì)和信息交換，使得細(xì)胞對(duì)環(huán)境的刺激作出協(xié)調(diào)一致的反應(yīng)。 Connexin 31(Cx31)是β屬間隙連接蛋白，突變可導(dǎo)致皮膚病、神經(jīng)性耳聾及周圍神經(jīng)病，一個(gè)基因的不同突變導(dǎo)致完全不相關(guān)的三種疾病的致病模式引起了許多研究者的關(guān)注，然而至今對(duì)其突變的致病機(jī)制知之甚少。報(bào)道認(rèn)為許多與間隙連接蛋白突變相關(guān)的遺傳性疾病是由于這些間隙連接蛋白的新陳代謝周期改變所致。較之其它間隙連接蛋白，Cx31具有相對(duì)較長(zhǎng)的半衰期，通過(guò)蛋白酶體和溶酶體兩條途徑降解，那么Cx31的致病突變的降解途徑和新陳代謝周期是否發(fā)生改變?而這些改變是否與疾病的致病機(jī)制相關(guān)呢? 為了探明這種疑問(wèn)，我們將Cx31野生型、耳聾及皮膚病相關(guān)的突變體分別克隆入pEGFP-N1質(zhì)粒中形成的融合基因轉(zhuǎn)染hela細(xì)胞，建立穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系來(lái)研究它們的降解和代謝途徑的差異。對(duì)于認(rèn)為可能導(dǎo)致hela細(xì)胞死亡的EKV相關(guān)突變體，采用轉(zhuǎn)染不傳代的方法篩選克隆，其他按常規(guī)方法操作。建立了Cx31野生型、4個(gè)耳聾相關(guān)突變(141delI，I141V，R180X，E183K)和4個(gè)皮膚病相關(guān)突變(G12D，L34P，R42P，F(xiàn)137L)的穩(wěn)定表達(dá)系。采用特異的蛋白酶抑制劑分別抑制蛋白酶體和溶酶體活性，通過(guò)熒光定位和Western Blot分析抑制前后細(xì)胞內(nèi)Cx31含量的變化，來(lái)研究Cx31野生型及各突變體降解途徑的差異及蛋白代謝的變化。 1)熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)： 蛋白酶體抑制劑MG132和溶酶體抑制CLQ作用10小時(shí)，可促使EKV相關(guān)突變體熒光顯著增強(qiáng)，，延長(zhǎng)前者的作用時(shí)間，能使這些突變體出現(xiàn)臨核熒光聚集，顯性EKV相關(guān)突變體細(xì)胞膜上有時(shí)會(huì)出現(xiàn)少量間隙連接斑，其它溶酶體抑制劑NH_4CL、E64、Leu對(duì)EKV相關(guān)突變體作用不大。Cx31野生型和耳聾突變體(141delI，I141V，E183K)在上述抑制劑的作用下，熒光強(qiáng)度變化不大，但會(huì)出現(xiàn)對(duì)之敏感的特征性指標(biāo)：細(xì)胞質(zhì)中分別會(huì)“囊泡樣”和“煎餅樣”熒光物質(zhì)增加。耳聾突變體R180X則對(duì)所有抑制劑都敏感。 2) Western Blot結(jié)果出現(xiàn)下面四種情況： ①經(jīng)蛋白酶體及不同溶酶體抑制劑處理10小時(shí)后，影響不大，包括較低表達(dá)的野生型及耳聾相關(guān)突變體(141delI／Cx31、I141V／Cx31、E183K／Cx31)。 ②蛋白酶體抑制劑MG132及溶酶體抑制劑CLQ抑制后，蛋白表達(dá)量顯著增高，其他溶酶體抑制劑抑制后，蛋白量變化不明顯，這些突變體包括EKV相關(guān)的突變體L34P／Cx31、F137L／Cx31。 ③蛋白酶體抑制劑MG132抑制后，蛋白表達(dá)量顯著增高；溶酶體抑制劑抑制后，蛋白量變化不明顯，這些包括EKV相關(guān)的突變體G12D／Cx31、R42P／Cx31。 ④蛋白酶體抑制劑MG132和溶酶體抑制劑NH_4CL、CLQ抑制后，蛋白表達(dá)量顯著增高，溶酶體抑制劑E64、Leu也可使其蛋白表達(dá)量增高，但蛋白酶體抑制劑MG132抑制后，蛋白量增加更明顯，包括高表達(dá)的野生型細(xì)胞系及耳聾相關(guān)突變體R180X／Cx31。 ⑤表達(dá)量不同的野生型細(xì)胞系對(duì)于抑制劑的反應(yīng)有所不同，可能是過(guò)表達(dá)的新生蛋白的干擾。在過(guò)表達(dá)的克隆中加入各種蛋白酶抑制劑同時(shí)加入蛋白合成抑制劑CHX。結(jié)果顯示經(jīng)這種處理后，MG132、NH_4CL、CLQ使野生型Cx31蛋白增加量差不多。 上述結(jié)果顯示：在Cx31的降解途徑中，蛋白酶體和溶酶體扮演不同的角色，蛋白酶體負(fù)責(zé)新生蛋白、錯(cuò)誤折疊蛋白及一部分成熟蛋白的降解，溶酶體主要負(fù)責(zé)較成熟蛋白的降解；EKV相關(guān)突變及耳聾突變R180X／Cx31大大加快了蛋白的半衰期，而其它耳聾突變對(duì)半衰期的影響不大。說(shuō)明Cx31突變導(dǎo)致不同的疾病與其降解和代謝具有相關(guān)性。 研究Cx31野生型及疾病相關(guān)突變的降解途徑中發(fā)現(xiàn)，EKV相關(guān)突變體在MG132的作用下，臨核位置出現(xiàn)類似aggresome樣的熒光聚集物，許多報(bào)道認(rèn)為aggresome樣蛋白聚集物是一些遺傳性疾病的特征性指標(biāo)，可能與這些疾病的致病機(jī)制相關(guān)。為了驗(yàn)證EKV相關(guān)突變體在MG132的作用下形成的熒光聚集物是否就是aggresome，探明這類疾病的致病機(jī)制，我們用與aggresome相關(guān)的一些特征性指標(biāo)(如聚集物與熱休克蛋白、泛素蛋白的共定位、中間纖維的塌陷以及聚集物能否被BFA或NOC逆轉(zhuǎn)。)來(lái)加以證實(shí)。 熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)： ①熱休克蛋白Hsp70c、泛素蛋白Ubiquitin在熒光聚集物處呈現(xiàn)高表達(dá)，有時(shí)Hsp70c形成籠形結(jié)構(gòu)環(huán)繞熒光聚集物， ②hela細(xì)胞中間纖維Vimentin塌陷，與熒光聚集物共定位。 ③阻止蛋白由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體運(yùn)輸?shù)乃幬顱FA不能逆轉(zhuǎn)熒光聚集物的形成，而破壞微管的藥物NOC，可以逆轉(zhuǎn)熒光聚集。 上述結(jié)果顯示：MG132的作用下，EKV相關(guān)突變體臨核位置出現(xiàn)的熒光聚集物，就是aggresome，提示Cx31突變導(dǎo)致的皮膚病，可能與這些突變蛋白由于降解異常而形成aggresome相關(guān)。 一些折疊、運(yùn)輸障礙的蛋白，通過(guò)低溫誘導(dǎo)，可以恢復(fù)它的功能；對(duì)于這些有“溫度依賴性”表達(dá)特征的蛋白，一些化學(xué)分子伴侶(如甘油、三甲酰胺)也具有相同的作用。Cx31皮膚病相關(guān)突變通過(guò)蛋白酶體迅速降解的原因，可能就是這些蛋白的錯(cuò)誤折疊啟動(dòng)了蛋白質(zhì)合成的質(zhì)量控制程序，被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的蛋白酶體降解，因此對(duì)于這些突變，也可能通過(guò)上述措施恢復(fù)其功能。為了探究皮膚病相關(guān)Cx31突變的致病機(jī)制，提供這類疾病治療的理論依據(jù)和可行性，我們分別采用低溫培養(yǎng)或加入化學(xué)分子伴侶的方法，通過(guò)熒光觀察、Western blot及染料轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)這些致病突變細(xì)胞系中熒光分布、間隙連接斑的形成、蛋白表達(dá)變化、及是否形成功能性的間隙連接通道。 觀察發(fā)現(xiàn)： ①Cx31顯性EKV相關(guān)突變體在低溫或化學(xué)分子伴侶(甘油、三甲酰胺)作用下，能夠形成間隙連接通道，染料轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)顯示這些通道是有功能的。隱性EKV相關(guān)突變L34P未發(fā)現(xiàn)間隙連接斑的出現(xiàn)，但熒光強(qiáng)度增加，且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞質(zhì)中囊泡樣熒光向遠(yuǎn)端分泌途徑分布。Cx31野生型表現(xiàn)為細(xì)胞間較大的間隙連接斑增加。 ②低溫促使Cx31野生型及皮膚病相關(guān)突變的蛋白表達(dá)量增加，皮膚病相關(guān)突變是因?yàn)榇龠M(jìn)了成熟蛋白的增加。 以上這些結(jié)果顯示：低溫誘導(dǎo)和化學(xué)分子伴侶可以恢復(fù)顯性EKV相關(guān)突變功能，幫助隱性EKV突變組裝，但不能確定是否可以恢復(fù)它的部分功能。 總之，上述結(jié)果表明：Cx31致皮膚病相關(guān)突變降解的異常及蛋白代謝周期改變，提示這類突變由于折疊或初期寡聚化異常，啟動(dòng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的蛋白酶體降解途徑，當(dāng)這些突變蛋白量超過(guò)蛋白酶體的負(fù)荷能力時(shí)，這些突變蛋白形成aggresome樣物質(zhì)沉積在鄰核位置，這可能是與這類疾病的致病機(jī)理相關(guān)。冷休克和化學(xué)分子伴侶可恢復(fù)EKV相關(guān)突變的功能，一方面為明確這類疾病的致病機(jī)制提供了可靠依據(jù)，另一方面為它的治療方案的設(shè)計(jì)提供了有力幫助。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R363

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本文編號(hào)：2297558