【摘要】： 【背景與目的】在眾多的免疫避孕候選抗原中，精子抗原被認(rèn)為是目前最有希望和最具應(yīng)用前景的避孕疫苗靶抗原。2005年，一種新的精子特異表達(dá)的精卵融合關(guān)鍵蛋白Izumo的發(fā)現(xiàn)可能為避孕疫苗的研究提供了新思路和新材料。本課題旨在研究原核表達(dá)的重組小鼠Izumo(mlzumo)蛋白的免疫避孕潛力，為重組mlzumo蛋白是否能作為避孕疫苗候選靶抗原提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和科學(xué)依據(jù)。 【材料與方法】①構(gòu)建pET28a(+)-mlzumo原核表達(dá)質(zhì)粒；②在大腸桿菌中表達(dá)帶有6His純化標(biāo)簽的重組蛋白6His-mlzumo；③固化Ni~(2+)親和層析純化重組蛋白6His-mIzumo，，并透析復(fù)性和Bradford法定量；④通過腹腔注射用6His-mIzumo免疫雌雄性C57BL／6小鼠；⑤Western blot檢測(cè)免疫小鼠血清抗6His-mlzumo IgG抗體的特異性；⑥ELISA檢測(cè)血清特異性抗體滴度隨免疫時(shí)間變化的規(guī)律；⑦精卵融合試驗(yàn)觀察免疫血清對(duì)小鼠體外精卵融合的影響；⑧雙熒光染色法對(duì)抗6His-mlzumo IgG抗體在精子上的識(shí)別部位進(jìn)行定位；⑨免疫小鼠在末次免疫后第2周與正常小鼠合籠，評(píng)價(jià)其生育力。 【結(jié)果】①成功構(gòu)建了pET28a(+)-mIzumo原核表達(dá)質(zhì)粒；②成功表達(dá)和得到了純化的重組蛋白6His-mlzumo；③雌性和雄性免疫小鼠體內(nèi)都能產(chǎn)生血清特異性抗6His-mIzumoIgG抗體，特異性抗體與天然mlzumo存在交叉反應(yīng)；④血清特異性抗6His-mIzumo IgG抗體開始出現(xiàn)在第一次加強(qiáng)免疫后第2周，末次免疫后第2周抗體滴度達(dá)到最高并至少持續(xù)到末次免疫后第6周；⑤6His-mlzumo免疫血清完全阻斷小鼠體外精卵融合的發(fā)生；⑥抗6His-mlzumo IgG抗體特異地識(shí)別的小鼠AR精子(發(fā)生了頂體反應(yīng)的精子)頭部頂體區(qū)；⑦雌性和雄性免疫小鼠的生育力與PBS對(duì)照組相比沒有明顯降低。 【結(jié)論】通過pET原核表達(dá)系統(tǒng)成功制備帶有6His純化標(biāo)簽的重組蛋白6His-mlzumo：6His-mlzumo對(duì)于雌性和雄性小鼠都具有免疫原性；雖然免疫重組mlzumo蛋白能夠使小鼠產(chǎn)生特異識(shí)別小鼠AR精子頭部頂體區(qū)并能阻斷體外精卵融合的血清特異性IgG抗體，但對(duì)雌性和雄性免疫小鼠生育力的影響不明顯。因此，原核表達(dá)的重組mlzumo蛋白可能對(duì)免疫小鼠沒有明顯的避孕作用，Izumo是否能作為避孕疫苗研制的靶抗原還需要進(jìn)一步的研究和探索。
[Abstract]:[background & objective] among the many candidate antigens for immune contraception, sperm antigens are considered to be the most promising and promising target antigens for contraceptive vaccine. The discovery of a new spermatozoa specifically expressed spermatozoa fusion key protein Izumo may provide new ideas and materials for the study of contraceptive vaccine. The purpose of this study was to study the immunological potential of recombinant mouse Izumo (mlzumo) protein expressed in prokaryotic cells, and to provide experimental data and scientific basis for whether recombinant mlzumo protein can be used as candidate antigen for contraceptive vaccine. [materials and methods] 1 to construct pET28a ()-mlzumo prokaryotic expression plasmid, 2 to express the recombinant protein 6His-mlzumo with 6His purified label in Escherichia coli. 3Recombinant protein 6His-mIzumo was purified by immobilized Ni~ (2) affinity chromatography, and refolded by dialysis and measured by Bradford assay. (4) female and male C57BL/6 mice were immunized by intraperitoneal injection of 6His-mIzumo, and the specificity of anti-6His-mlzumo IgG antibody in serum of immunized mice was detected by 5Western blot. The changes of serum specific antibody titer with immune time were detected by 6ELISA, and the effect of immunized serum on mouse spermatozoa fusion in vitro was observed by sperm-egg fusion test. (8) double fluorescent staining was used to locate the recognition site of 6His-mlzumo IgG antibody on sperm, and 9 mice were incubated with normal mice at the 2nd week after the last immunization to evaluate their fertility. [results] 1 the prokaryotic expression plasmid of pET28a ()-mIzumo was successfully constructed, 2 the recombinant protein 6His-mlzumo was successfully expressed and purified. (3) in both female and male immunized mice, serum specific anti 6His-mIzumoIgG antibodies were produced, and there was a cross reaction between the specific antibodies and natural mlzumo. (4) the serum specific anti 6His-mIzumo IgG antibody began to appear at the second week after the first immunization, and the titer of the antibody reached the highest level at the second week after the last immunization and lasted until at least 6 weeks after the last immunization. 56His-mlzumo immune serum completely blocked the development of mouse spermatozoa fusion in vitro. 6) the acrosome region of mouse AR sperm (sperm with acrosome reaction) was specifically recognized by anti 6His-mlzumo IgG antibody. The fertility of female and male immunized mice was not significantly lower than that of PBS control group. [conclusion] the recombinant protein 6His-mlzumo:6His-mlzumo with 6His purified label was successfully prepared by pET prokaryotic expression system for both female and male mice. Although the recombinant mlzumo protein can make mice produce specific serum-specific IgG antibodies that specifically recognize the acrosome region of mouse AR sperm head and block the fusion of spermatozoa in vitro, the effect on fertility of female and male immunized mice is not obvious. Therefore, the recombinant mlzumo protein expressed in prokaryotic cells may not have significant contraceptive effect on immunized mice. Whether Izumo can be used as the target antigen of contraceptive vaccine should be further studied and explored.
【學(xué)位授予單位】：汕頭大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R392

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 朱曄敏;劉悅;郭強(qiáng)蘇;匡f 哲;丁之德;;大鼠ERp57基因的原核表達(dá)及在精卵中的鑒定和定位[J];中國(guó)男科學(xué)雜志;2010年10期

2 ;[J];;年期

3 ;[J];;年期

4 ;[J];;年期

5 ;[J];;年期

6 ;[J];;年期

7 ;[J];;年期

8 ;[J];;年期

9 ;[J];;年期

10 ;[J];;年期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 劉利敏;陳德宇;黃天華;;精卵融合過程中關(guān)鍵精子膜蛋白的研究進(jìn)展[A];中國(guó)遺傳學(xué)會(huì)第八次代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要匯編（2004-2008）[C];2008年

2 陳文穎;許文明;陳璋輝;石其賢;周思暢;李坤;孫麗文;陳小章;袁玉英;倪崖;;CL~-及其通道在精子獲能和精卵融合中的作用[A];第二屆中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)暨細(xì)胞生物學(xué)教學(xué)改革會(huì)議論文集[C];2008年

3 江澍;林典梁;陳文列;江一平;;人精子甘露糖受體對(duì)地鼠卵母細(xì)胞的影響[A];2007年中國(guó)解剖學(xué)會(huì)第十屆全國(guó)組織學(xué)與胚胎學(xué)青年學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要匯編[C];2007年

4 楊欣;顏志中;;活性氧對(duì)人精子功能的影晌[A];2005年浙江省男科學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2005年

5 娜仁花;旭日干;;四種精子膜抗原mRNA在綿羊睪丸和附睪中的表達(dá)[A];第十屆全國(guó)生殖生物學(xué)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2005年

6 江澍;林典梁;江一平;;抗人精子甘露糖受體抗血清對(duì)精子穿透實(shí)驗(yàn)的影響[A];2007年中國(guó)解剖學(xué)會(huì)第十屆全國(guó)組織學(xué)與胚胎學(xué)青年學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要匯編[C];2007年

7 申家恒;;被子植物雌雄性細(xì)胞融合超微結(jié)構(gòu)研究的一些設(shè)想[A];中國(guó)植物學(xué)會(huì)植物結(jié)構(gòu)與生殖生物學(xué)專業(yè)委員會(huì)、江蘇省植物學(xué)會(huì)2007年學(xué)術(shù)年會(huì)學(xué)術(shù)報(bào)告及研究論文集[C];2007年

8 湯洋;譚雪梅;張義正;;大熊貓CD9基因的克隆、表達(dá)及活性分析[A];中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)第九次會(huì)員代表大會(huì)暨青年學(xué)術(shù)大會(huì)論文摘要集[C];2007年

9 劉樹碩;;慢性前列腺炎所致男性不育機(jī)制的研究進(jìn)展[A];浙江省中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)生殖醫(yī)學(xué)專業(yè)委員會(huì)第八次學(xué)術(shù)年會(huì)暨國(guó)家級(jí)繼續(xù)教育學(xué)習(xí)班資料匯編[C];2008年

10 陳文穎;許文明;陳璋輝;石其賢;倪崖;周思暢;李坤;孫麗文;陳小章;袁玉英;;氯離子及其通道在豚鼠精子獲能中的作用[A];第一屆中華醫(yī)學(xué)會(huì)生殖醫(yī)學(xué)分會(huì)、中國(guó)動(dòng)物學(xué)會(huì)生殖生物學(xué)分會(huì)聯(lián)合年會(huì)論文匯編[C];2007年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前3條

1 湘雅醫(yī)院婦產(chǎn)科副教授 劉冬娥;不孕癥要從夫妻雙方找原因[N];大眾衛(wèi)生報(bào);2001年

2 傅繼梁 （上海第二軍醫(yī)大學(xué)教授）;克隆技術(shù)理論尚待突破[N];文匯報(bào);2003年

3 記者 曾繁玉 通訊員 王洪新 劉青;免疫性不育癥治療獲突破[N];健康報(bào);2000年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前3條

1 邢萬金;絨山羊和綿羊Izumo1和CD9基因的克隆及其相互作用的初步研究[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2009年

2 娜仁花;綿羊精子膜蛋白基因的表達(dá)研究[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2006年

3 張皓;S型氯代甘油醇對(duì)精子獲能相關(guān)蛋白磷酸化的影響及機(jī)制研究[D];復(fù)旦大學(xué);2012年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 王德剛;重組小鼠精子蛋白Izumo的制備及其免疫避孕潛力的研究[D];汕頭大學(xué);2007年

2 安剛;pCXN2-mIZUMO對(duì)小鼠C57BL/6生育能力的影響[D];汕頭大學(xué);2007年

3 梁磊;絨山羊Izumo基因的克隆及組織表達(dá)[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

4 鄭穎;精卵融合過程中卵母細(xì)胞膜表面相關(guān)分子的研究進(jìn)展[D];山東大學(xué);2008年

5 林典梁;人精子甘露糖受體純化及其對(duì)受精能力的影響[D];福建醫(yī)科大學(xué);2002年

6 張菁菁;人精子蛋白ERp57的功能研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2007年

7 劉志春;人精子甘露糖受體的純化及其肽質(zhì)量指紋譜鑒定[D];福建醫(yī)科大學(xué);2008年

8 江澍;人精子甘露糖受體對(duì)精卵融合的影響[D];福建醫(yī)科大學(xué);2002年

9 烏吉斯古冷;絨山羊和綿羊Izumo4和Tssk6 cDNA克隆及與其它精卵融合相關(guān)蛋白質(zhì)的作用研究[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2012年

10 王鳳超;重組蛋白tMDC-Ⅲ、SP-10、AEG的免疫原性及其生殖作用[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2002年

本文編號(hào)：2296937