【摘要】： 隱孢子蟲屬于頂復(fù)門胞內(nèi)寄生機(jī)會(huì)致病性原蟲，可感染人和多種動(dòng)物，引起以腹瀉為主要癥狀的隱孢子蟲病，是危害全球的公共衛(wèi)生問題，至今仍無有效的控制和治療手段。大量研究表明，高滴度牛初乳(HBC)、高滴度牛初乳免疫球蛋白(HBCIg)、一系列針對隱孢子蟲表面致病相關(guān)蛋白的特異性多克隆抗體及鼠源單克隆抗體等均可在動(dòng)物或人體內(nèi)產(chǎn)生抗隱孢子蟲作用，證明了被動(dòng)免疫治療隱孢子蟲感染的有效性，故本研究擬進(jìn)一步研制隱孢子蟲特異性人源抗體。 首先從奶牛糞便中分離、鑒定、純化獲得微小隱孢子蟲卵囊，感染SCID小鼠保種；以微小隱孢子蟲卵囊免疫志愿者，獲得含有較高滴度抗微小隱孢子蟲IgG抗體的外周血，從中分離淋巴細(xì)胞，利用工程抗體技術(shù)構(gòu)建非依賴性克隆滴度為8×10~6的人抗隱孢子蟲免疫球蛋白G基因文庫；選擇位于隱孢子蟲胞外發(fā)育階段蟲體表面和頂端、直接參與蟲體對宿主細(xì)胞的吸附和入侵過程的糖蛋白gp40／15作為抗體庫篩選的抗原靶的，應(yīng)用DNA重組技術(shù)將擴(kuò)增得到的Cpgp40／15基因克隆入原核表達(dá)載體pET19b中，轉(zhuǎn)化宿主菌、誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，純化得到可被含有抗微小隱孢子蟲特異性抗體的血清識(shí)別、具有特異免疫原性的重組抗原gp40／15，每100ml培養(yǎng)菌液中可獲得高純度重組蛋白3.6mg；采用克隆印跡法和ELISA對抗體庫進(jìn)行多輪篩選，共篩選克隆數(shù)約為1.01×10~6個(gè)，經(jīng)ELISA、IFA等方法反復(fù)驗(yàn)證，最終獲得兩個(gè)陽性克隆，分別命名為Agp40—1和Agp40—2；Agp40-1的輕鏈可變區(qū)近似系為A20，基因同源性為95％；重鏈可變區(qū)近似系為VH3-30，基因同源性為92％；Agp40-2的輕鏈可變區(qū)近似系為O12，基因同源性為97％；重鏈可變區(qū)近似系為VH3-30，基因同源性為92％；分別對兩個(gè)陽性克隆進(jìn)行大量表達(dá)，并以金屬螯合親和層析法進(jìn)行純化，得到重輕鏈結(jié)構(gòu)完整、純度較高的抗體Fab片段，得量為1mg／L培養(yǎng)液；經(jīng)ELSIA、斑點(diǎn)印跡、免疫印跡、IFA等檢測證實(shí)兩個(gè)純化Fab片段均可特異性識(shí)別天然及重組微小隱孢子蟲表面抗原；Biacore檢測分析表明，Agp40-1的解離常數(shù)為5.25×10~(-9)，，Agp40-2的解離常數(shù)為1.47×10~(-9)，均具有較高的親和力；體外功能檢測中，兩個(gè)純化Fab片段對微小隱孢子蟲卵囊感染宿主細(xì)胞(Caco-2)具有一定的抑制作用，對微小隱孢子蟲子孢子附著宿主細(xì)胞(Caco-2)具有一定的阻斷作用。 上述人源性抗隱孢子蟲工程抗體IgG Fab片段的制備和研究工作，為進(jìn)一步發(fā)展被動(dòng)免疫策略治療和預(yù)防隱孢子蟲感染提供了理論和實(shí)踐依據(jù)。
[Abstract]:Cryptosporidium belongs to opportunistic protozoa, which can infect human and many animals and cause Cryptosporidiosis with diarrhea as its main symptom. Cryptosporidium is a global public health problem, and there are no effective control and treatment methods. A great deal of research has shown that High titer bovine colostrum (HBC), high titer bovine colostrum immunoglobulin (HBCIg), a series of specific polyclonal antibodies against Cryptosporidium surface pathogenicity related proteins, and murine monoclonal antibodies can produce anti-Cryptosporidium effects in animals or human beings. It is proved that passive immunotherapy is effective in the treatment of Cryptosporidium infection, so this study intends to further develop the specific human antibody against Cryptosporidium. Firstly, Cryptosporidium microspore oocysts were isolated from cow feces, identified, purified and preserved in SCID mice. The peripheral blood containing higher titer of IgG antibody against Cryptosporidium microsporidium was obtained by immunizing volunteers with Cryptosporidium microsporidium oocysts. The G gene library of human Cryptosporidium immunoglobulin (Ig) was constructed by using engineering antibody technique, and was selected to be located on the surface and apical of Cryptosporidium during the extracellular development stage of Cryptosporidium, and the immunoglobulin G gene library of Cryptosporidium was constructed by using engineering antibody technique. Glycoprotein gp40/15, which is directly involved in the adsorption and invasion of host cells, was used as the antigen target of antibody library screening. The amplified Cpgp40/15 gene was cloned into the prokaryotic expression vector pET19b by DNA recombination technique and transformed into host strain. The recombinant protein was induced to express and purified to be recognized by sera containing specific antibodies against Cryptosporidium minimus. The recombinant antigen gp40/15, with specific immunogenicity could obtain high purity recombinant protein 3.6 mg per 100ml culture solution. The antibody library was screened by clone blot and ELISA. The total number of clones screened was about 1.01 脳 106. After repeated verification by ELISA,IFA and other methods, two positive clones were obtained, named Agp40-1 and Agp40-2;, respectively. The light chain variable region approximate line of Agp40-1 is A20, the gene homology is 95%, the heavy chain variable region approximate line is VH3-30, gene similarity 92Agp40-2, the light chain variable region approximate line is O12, and the gene homology is 97%. The similarity of heavy chain variable region was that the homology of VH3-30, gene was 92.The two positive clones were respectively expressed in large quantities and purified by metal chelating affinity chromatography to obtain Fab fragments with complete heavy and light chain structure and high purity. ELSIA, dot blot, Western blot, IFA and so on confirmed that two purified Fab fragments could specifically recognize natural and recombinant surface antigens of Cryptosporidium minimus. Biacore analysis showed that the dissociation constants of Agp40-1 and Agp40-2 were 5.25 脳 10 ~ (-9) and 1.47 脳 10 ~ (-9), respectively. It can block the attachment of Cryptosporidium microspore spores to host cells (Caco-2). The preparation and study of the IgG Fab fragment of human engineering antibody against Cryptosporidium provided a theoretical and practical basis for the further development of passive immunization strategy for the treatment and prevention of Cryptosporidium infection.
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號(hào)】：R392

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 馬君濤,常向秀;大蒜糖漿治愈隱孢子蟲感染2例[J];時(shí)珍國醫(yī)國藥;1998年03期

2 崔巍!261042,梁瑞文!261042,王尊哲!261042;濰坊地區(qū)兒童隱孢子蟲感染的流行病學(xué)調(diào)查[J];中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;2001年04期

3 楊興友,王光西;人體隱孢子蟲病流行狀況[J];寄生蟲病與感染性疾病;2005年03期

4 甘志高，陳俊民，賀雪春，羅潔，李玉霜，潘群慧，陳培堅(jiān);柳州市人、畜隱孢子蟲感染調(diào)查[J];中國寄生蟲病防治雜志;1995年01期

5 周永華;隱孢子蟲感染和隱孢子蟲腸炎[J];重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);1987年01期

6 羅衛(wèi)平,李寶山,駱玲,童蘇祥,劉艷,索菲亞,董強(qiáng),王玲;烏魯木齊市腹瀉病人隱孢子蟲感染的初步調(diào)查[J];地方病通報(bào);2002年02期

7 陳心春;張泉順;周伯平;王輝;劉艷;張路坤;Saul Tzipori;馮漢平;;抗人隱孢子蟲特異性單克隆抗體的制備[J];中國熱帶醫(yī)學(xué);2007年12期

8 李景琦,侯云圣,劉俊哲,田宏林,李征教;西安近郊小牛隱孢子蟲感染情況初步調(diào)查[J];中國人獸共患病雜志;1991年06期

9 陳淑蘭,曹志然;隱孢子蟲感染者紅細(xì)胞免疫功能的檢測[J];中國寄生蟲病防治雜志;2000年02期

10 黃民主,關(guān)嵐,李登清,劉愛忠,戴衛(wèi)平,陳曦;男性靜脈吸毒人員中隱孢子蟲感染的調(diào)查[J];中國人獸共患病雜志;2002年02期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 楊光;周天鴻;李月琴;余新炳;朱一;馬慧璇;荊春霞;;應(yīng)用巢式PCR方法診斷隱孢子蟲感染的實(shí)驗(yàn)研究[A];全國寄生蟲學(xué)與熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2008年

2 周望平;肖兵南;;湖南省三市禽隱孢子蟲感染情況調(diào)查[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)禽病學(xué)會(huì)分會(huì)第十次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2000年

3 郭禮和;盧步峰;;完全人源抗體轉(zhuǎn)基因鼠研制[A];中國生物工程學(xué)會(huì)2006年學(xué)術(shù)年會(huì)暨全國生物反應(yīng)器學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2006年

4 朱惠利;李家誠;黨海亮;張龍現(xiàn);寧長申;;人獸共患隱孢子蟲的種類和基因型[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜寄生蟲學(xué)分會(huì)第九次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2006年

5 常宏;秦衛(wèi)松;馮健男;黎燕;沈倍奮;;新型TNF-α抗體的研究[A];中國免疫學(xué)會(huì)第五屆全國代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要[C];2006年

6 陳兆國;米榮升;于慧珠;夏延富;胡義彬;郝言明;李艷;李正鋒;石耀軍;林矯矯;;上海地區(qū)豬隱孢子蟲感染調(diào)查及蟲種鑒定[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜寄生蟲學(xué)分會(huì)第六次代表大會(huì)暨第十次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2009年

7 王慧珠;焦炳欣;田敬華;李敏;郭杰;劉穎;李興旺;王玉光;;北京、河南、新疆三地HIV/AIDS相關(guān)性慢性腹瀉患者中隱孢子蟲感染的調(diào)查研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第五次全國艾滋病、病毒性丙型肝炎暨全國熱帶病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2011年

8 陳建平;廖宛軍;陳盛文;張雷;劉明杰;;成都及周邊地區(qū)五種動(dòng)物隱孢子蟲感染的調(diào)查[A];中國動(dòng)物學(xué)會(huì)原生動(dòng)物學(xué)分會(huì)第十二次學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要匯編[C];2003年

9 王慧珠;焦炳欣;田敬華;李敏;郭杰;劉穎;李興旺;王玉光;;北京、河南、新疆三地HIV/AIDS相關(guān)性慢性腹瀉患者中隱孢子蟲感染的調(diào)查研究[A];中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)防治艾滋病分會(huì)第八次年會(huì)論文集[C];2011年

10 賴增祖;熊冬生;許元富;彭輝;范冬梅;邵曉楓;;基于抗體結(jié)構(gòu)的抗腫瘤小分子模擬物研究[A];第四屆中國新醫(yī)藥博士論壇論文集[C];1999年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 胡德榮;滬建立首個(gè)SARS人源抗體基因庫[N];中國醫(yī)藥報(bào);2003年

2 記者 李天舒;抗狂犬病毒人源抗體制備成功[N];健康報(bào);2011年

3 記者 駱紅初;隔離SARS與人體“第三者”露面 全球首個(gè)人源抗體基因庫建成[N];上�？萍紙�(bào);2003年

4 張忠霞;兩種阻斷非典病毒的人源抗體被發(fā)現(xiàn)[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2007年

5 張忠霞;阻擋非典病毒,首次找到兩種人源抗體[N];新華每日電訊;2007年

6 本報(bào)記者　 賴強(qiáng);單抗藥物期待中國加速度[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2006年

7 黃東臨;羅氏叱咤單克隆抗體市場[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2005年

8 記者 周潤健 張澤偉;六大措施促醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)大發(fā)展[N];經(jīng)濟(jì)參考報(bào);2007年

9 本報(bào)特約撰稿人 李朝;單抗：生物醫(yī)藥發(fā)展的主旋律[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2006年

10 岳聞業(yè);知不足而奮進(jìn) 彌差距惟自強(qiáng)[N];中國醫(yī)藥報(bào);2006年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 劉金也;隱孢子蟲特異性人源抗體Fab片段的制備和研究[D];復(fù)旦大學(xué);2006年

2 方晨;Her2全人源抗體的制備及生物學(xué)功能研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2011年

3 付永鋒;抗剛地弓形蟲特異性人源抗體Fab片段的制備和研究[D];復(fù)旦大學(xué);2008年

4 康曉平;抗SARS病毒人源Fab抗體的制備研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2005年

5 馬小兵;人天然Fab段噬菌體抗體庫的構(gòu)建及抗gp96抗體的初步篩選[D];天津醫(yī)科大學(xué);2006年

6 王輝;大容量天然噬菌體抗體庫的建立、篩選及抗DR5抗體的鑒定[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2008年

7 蔡炯;老年性癡呆（阿爾茨海默�。│碌矸蹣拥鞍兹嗽纯贵w的體外篩選和表達(dá)[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2003年

8 劉夢元;抗TNF-α多價(jià)抗體的構(gòu)建及體內(nèi)外生物學(xué)活性研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2005年

9 王昕;人源抗EGFR重組Fab的篩選及其免疫標(biāo)記紫杉醇體外抗腫瘤作用的研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2007年

10 孟露露;基于表位預(yù)測的抗B型肉毒毒素基因工程抗體的研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2006年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 趙梅珍;上海一株豬源隱孢子蟲的蟲種鑒定及遵義市人畜隱孢子蟲感染的初步調(diào)查[D];遵義醫(yī)學(xué)院;2011年

2 許禮發(fā);安徽省隱孢子蟲感染流行病學(xué)調(diào)查及感染者細(xì)胞免疫功能表達(dá)的研究[D];安徽理工大學(xué);2005年

3 趙媛媛;隱孢子蟲感染動(dòng)物模型的建立及其免疫機(jī)制研究[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2010年

4 米榮升;上海地區(qū)不同動(dòng)物源隱孢子蟲種型鑒定及微小隱孢子蟲CP15和P23基因的克隆和表達(dá)[D];新疆農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

5 喬媛媛;大容量噬菌體抗體庫的構(gòu)建及鑒定[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2005年

6 李巖;沈陽地區(qū)腹瀉患者和吸毒人群隱孢子蟲感染的調(diào)查[D];中國醫(yī)科大學(xué);2005年

7 宋丹;隱孢子蟲檢測方法的比較及東北虎和觀賞鳥感染隱孢子蟲情況的調(diào)查[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

8 于麗萍;犬隱孢子蟲的鑒定及隱孢子蟲感染對小鼠免疫指標(biāo)的影響[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

9 徐文龍;安徽部分地區(qū)奶牛隱孢子蟲感染情況調(diào)查及其基因型研究[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

10 武林;隱孢子蟲感染對奶牛生理生化指標(biāo)及生產(chǎn)性能影響的研究[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

本文編號(hào)：2289055