【摘要】： 阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)的兩大主要神經病理學特征之一是大量形成以過度磷酸化的微管相關蛋白tau為主要成分的神經原纖維纏結(neurofibrillary tangles，NFTs)。AD患者腦中異常過度磷酸化的tau的聚積是導致神經元功能受損的重要原因，但其機制尚不清楚。體外研究發(fā)現(xiàn)從AD患者腦中提取的由過度磷酸化的tau形成的雙螺旋絲結構(PHF)中，tau蛋白不僅被磷酸化，還被泛素化，而后者是被蛋白酶小體降解的重要信號。進一步研究發(fā)現(xiàn)：AD患者腦中蛋白酶小體的活性是降低的，且PHF在體外可直接抑制蛋白酶小體的活性，但tau蛋白磷酸化和蛋白酶小體抑制之間的關系尚不清楚。本研究的主要目的是探討蛋白酶小體活性抑制對tau蛋白磷酸化的影響以及磷酸化tau蛋白對蛋白酶小體活性的調節(jié)及其可能機制，并獲得如下主要研究結果： 1．抑制蛋白酶小體導致HEK293／tau441細胞中總tau蛋白含量增加 用不同濃度的lactacystin(2.5μM，5μM，10μM)作用細胞后，用熒光底物Boc-Leu-Ser-Thr-Arg-AMC檢測蛋白酶小體胰蛋白酶樣的活性，結果發(fā)現(xiàn)蛋白酶小體的的活性被lactacystin呈劑量依賴性抑制，其抑制程度分別為對照組的58％、28％、11％。同時，用識別總tau的單克隆抗體Tau-5、多克隆抗體R134d進行免疫印跡檢測細胞中的總tau蛋白的含量，結果顯示：隨著lactacystin(2.5μM，5μM，10μM)誘導的蛋白酶小體活性的下降，細胞內總tau蛋白的含量增加，為了排除這種結果是由于蛋白合成增加而不是降解減少而產生的，我們用放線菌酮抑制了蛋白的翻譯過程，也獲得相同的結果，說明tau蛋白可能是被蛋白酶小體降解的，是蛋白酶小體的降解底物。 2．抑制蛋白酶小體導致HEK293／tau441細胞中磷酸化tau蛋白含量增加 同樣用lactacystin抑制細胞蛋白酶小體的活性，用識別非磷酸化Ser198／199／202位點的Tau-1以及識別磷酸化Ser396／404位點的PHF-1識別磷酸化Ser262位點的PS262識別磷酸化Thr231位點的PT231進行免疫印跡檢測細胞中的tau蛋白的磷酸化，結果顯示：與對照組細胞相比，lactacystin加藥組細胞中Tau-1、PS262、PHF-1、PT231的免疫反應均明顯增加，說明蛋白酶小體活性抑制可以導致細胞內tau蛋白的聚積，，包括磷酸化的tau和非磷酸化的tau蛋白，但由于總tau蛋白含量也有改變，經過與總tau蛋白的對比后發(fā)現(xiàn)PS262、PHF-1、PT231的免疫反應還是明顯增加，而Tau-1的免疫反應減弱，表明蛋白酶小體一方面可以通過減少tau蛋白的降解來增加磷酸化和非磷酸化的tau，另一方面可能通過其他的機制來促進tau蛋白的磷酸化，而且在tau—1位點這種磷酸化的作用要強于蛋白酶小體的抑制導致的聚積，從而表現(xiàn)出了tau—1位點的磷酸化增強。 3．抑制蛋白酶小體導致HEK293／tau441細胞中GSK-3活性增高 由于lactacystin誘導的tau磷酸化位點大部分都是GSK-3的磷酸化位點，GSK-3是磷酸化tau蛋白的關鍵性蛋白激酶，其中9位絲氨酸是GSK-3β活性調節(jié)的磷酸化位點，通過免疫印跡檢測GSK-3β總量及9位磷酸化位點的表達發(fā)現(xiàn)：9位磷酸化位點表達下降，GSK-3β總量也略有減少，結果提示GSK-3β的活性升高，我們進一步通過γ-~(32)P放射性同位素檢測了GSK-3的活性，結果顯示GSK-3的活性升高，為了進一步探討GSK-3在lactacystin誘導的tau的磷酸化中的作用，我們用LiCl抑制GSK-3的活性，發(fā)現(xiàn)LiCl可以在PHF-1和Thr231位點部分恢復lactacystin所誘導的tau的磷酸化，更加說明了GSK-3在lactacystin誘導的tau的磷酸化中的作用。 4．抑制蛋白酶小體導致HEK293／tau441細胞中PP-2A活性降低及其機制 PP-2A是調節(jié)tau蛋白磷酸化的關鍵的磷酸酯酶，通過γ~(32)P放射性同位素檢測了PP-2A的活性，發(fā)現(xiàn)PP-2A活性下降。 為了闡明蛋白酶小體抑制后是通過什么途徑來調節(jié)PP-2A的活性的，我們用lactacystin抑制蛋白酶小體的活性，并檢測PP-2A抑制劑1的表達，結果發(fā)現(xiàn)了PP-2A抑制劑1的表達明顯增加，這說明PP-2A抑制劑1也可能是通過蛋白酶小體來降解的，蛋白酶小體的活性下降導致了PP-2A抑制劑1表達增加，同時PP-2A抑制劑1作用于PP-2A引起了PP-2A的活性下降。 上述結果證明了抑制蛋白酶小體活性可導致細胞內tau蛋白聚積及其可能的機制。為了進一步研究tau的磷酸化對蛋白酶小體活性的影響，我們將人最長tau異構體(tau441)穩(wěn)定轉染到HEK293細胞內，用不同濃度的蛋白激酶A(PKA)的激活劑Forskolin處理細胞，誘導細胞內tau蛋白過度磷酸化，研究tau蛋白磷酸化對蛋白酶小體活性的影響。結果如下： 1．Forskolin誘導tau蛋白的過度磷酸化 我們首先用蛋白激酶PKA的激活劑forskolin作用于轉tau的HEK293細胞，并觀察細胞內tau蛋白磷酸化狀態(tài)。通過Western blot對tau蛋白的不同磷酸化位點(PS262，PHF-1，Tau-1，PS262)檢測發(fā)現(xiàn)：細胞內的tau蛋白隨forskolin(0.5μM，1μM，2μM，4μM)劑量增加而磷酸化的水平也增高，而細胞內的總tau蛋白的量沒有明顯改變。 2．Forskolin誘導tau蛋白聚積 tau蛋白的過度磷酸化可能是導致其在HEK293／tau441細胞內形成聚積體的原因。為了驗證這一想法，我們同時做了tau蛋白PS214位點的免疫熒光及thioflavin-S染色。結果發(fā)現(xiàn)：在對照組細胞內，PS214的染色弱，thioflavin-S染色陽性的比率也小于5％。當用2gM forskolin處理細胞后，PS214的染色明顯增加，thioflavin-S染色陽性的比率也有所增加(＞20％)，只是增加的程度遠沒有磷酸化的程度強。疊加后顯示thioflavin-S染色陽性沉積遠小于磷酸化的tau染色。用4μM forskolin處理HEK293／tau441發(fā)現(xiàn)PS214染色和21μM forskolin比僅有少許增加，而thioflavin-S陽性聚積體的形成則異常明顯(＞60％)。疊加后顯示出thioflavin-S染色陽性沉積和磷酸化的tau染色共定位于細胞內，提示磷酸化的tau蛋白在細胞內形成了廣泛的聚積體。 3．tau蛋白的磷酸化對蛋白酶小體的活性具有雙向調節(jié)作用 為了檢測tau蛋白的磷酸化水平對蛋白酶小體活性的影響，我們用Forskolin誘導tau的磷酸化，用熒光底物Boc-Leu-Ser-Thr-Arg-AMC檢測蛋白酶小體胰蛋白酶樣的活性，結果顯示較低程度的tau磷酸化可激活蛋白酶小體，而當tau的磷酸化升高到一定程度時，則可明顯抑制其活性。該結果提示蛋白酶小體功能的抑制在AD的病變過程中可能是一個較晚的過程，可繼發(fā)于tau的異常過度磷酸化。 根據上述研究結果，我們得出如下結論：lactacystin抑制蛋白酶小體活性可導致細胞內tau蛋白含量增高；GSK-3的激活和PP-2A的抑制參與了磷酸化tau蛋白的聚積，且PP-2A活性的下調與PP-2A抑制劑1含量升高有關；一定程度過度磷酸化的tau蛋白呈雙向性調節(jié)(激活或抑制)蛋白酶小體活性。
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【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2006
【分類號】：R363

【共引文獻】

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本文編號：2280519