【摘要】： 阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)的兩大主要神經(jīng)病理學(xué)特征之一是大量形成以過度磷酸化的微管相關(guān)蛋白tau為主要成分的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTs)。AD患者腦中異常過度磷酸化的tau的聚積是導(dǎo)致神經(jīng)元功能受損的重要原因，但其機(jī)制尚不清楚。體外研究發(fā)現(xiàn)從AD患者腦中提取的由過度磷酸化的tau形成的雙螺旋絲結(jié)構(gòu)(PHF)中，tau蛋白不僅被磷酸化，還被泛素化，而后者是被蛋白酶小體降解的重要信號。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)：AD患者腦中蛋白酶小體的活性是降低的，且PHF在體外可直接抑制蛋白酶小體的活性，但tau蛋白磷酸化和蛋白酶小體抑制之間的關(guān)系尚不清楚。本研究的主要目的是探討蛋白酶小體活性抑制對tau蛋白磷酸化的影響以及磷酸化tau蛋白對蛋白酶小體活性的調(diào)節(jié)及其可能機(jī)制，并獲得如下主要研究結(jié)果： 1．抑制蛋白酶小體導(dǎo)致HEK293／tau441細(xì)胞中總tau蛋白含量增加 用不同濃度的lactacystin(2.5μM，5μM，10μM)作用細(xì)胞后，用熒光底物Boc-Leu-Ser-Thr-Arg-AMC檢測蛋白酶小體胰蛋白酶樣的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白酶小體的的活性被lactacystin呈劑量依賴性抑制，其抑制程度分別為對照組的58％、28％、11％。同時，用識別總tau的單克隆抗體Tau-5、多克隆抗體R134d進(jìn)行免疫印跡檢測細(xì)胞中的總tau蛋白的含量，結(jié)果顯示：隨著lactacystin(2.5μM，5μM，10μM)誘導(dǎo)的蛋白酶小體活性的下降，細(xì)胞內(nèi)總tau蛋白的含量增加，為了排除這種結(jié)果是由于蛋白合成增加而不是降解減少而產(chǎn)生的，我們用放線菌酮抑制了蛋白的翻譯過程，也獲得相同的結(jié)果，說明tau蛋白可能是被蛋白酶小體降解的，是蛋白酶小體的降解底物。 2．抑制蛋白酶小體導(dǎo)致HEK293／tau441細(xì)胞中磷酸化tau蛋白含量增加 同樣用lactacystin抑制細(xì)胞蛋白酶小體的活性，用識別非磷酸化Ser198／199／202位點的Tau-1以及識別磷酸化Ser396／404位點的PHF-1識別磷酸化Ser262位點的PS262識別磷酸化Thr231位點的PT231進(jìn)行免疫印跡檢測細(xì)胞中的tau蛋白的磷酸化，結(jié)果顯示：與對照組細(xì)胞相比，lactacystin加藥組細(xì)胞中Tau-1、PS262、PHF-1、PT231的免疫反應(yīng)均明顯增加，說明蛋白酶小體活性抑制可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)tau蛋白的聚積，，包括磷酸化的tau和非磷酸化的tau蛋白，但由于總tau蛋白含量也有改變，經(jīng)過與總tau蛋白的對比后發(fā)現(xiàn)PS262、PHF-1、PT231的免疫反應(yīng)還是明顯增加，而Tau-1的免疫反應(yīng)減弱，表明蛋白酶小體一方面可以通過減少tau蛋白的降解來增加磷酸化和非磷酸化的tau，另一方面可能通過其他的機(jī)制來促進(jìn)tau蛋白的磷酸化，而且在tau—1位點這種磷酸化的作用要強(qiáng)于蛋白酶小體的抑制導(dǎo)致的聚積，從而表現(xiàn)出了tau—1位點的磷酸化增強(qiáng)。 3．抑制蛋白酶小體導(dǎo)致HEK293／tau441細(xì)胞中GSK-3活性增高 由于lactacystin誘導(dǎo)的tau磷酸化位點大部分都是GSK-3的磷酸化位點，GSK-3是磷酸化tau蛋白的關(guān)鍵性蛋白激酶，其中9位絲氨酸是GSK-3β活性調(diào)節(jié)的磷酸化位點，通過免疫印跡檢測GSK-3β總量及9位磷酸化位點的表達(dá)發(fā)現(xiàn)：9位磷酸化位點表達(dá)下降，GSK-3β總量也略有減少，結(jié)果提示GSK-3β的活性升高，我們進(jìn)一步通過γ-~(32)P放射性同位素檢測了GSK-3的活性，結(jié)果顯示GSK-3的活性升高，為了進(jìn)一步探討GSK-3在lactacystin誘導(dǎo)的tau的磷酸化中的作用，我們用LiCl抑制GSK-3的活性，發(fā)現(xiàn)LiCl可以在PHF-1和Thr231位點部分恢復(fù)lactacystin所誘導(dǎo)的tau的磷酸化，更加說明了GSK-3在lactacystin誘導(dǎo)的tau的磷酸化中的作用。 4．抑制蛋白酶小體導(dǎo)致HEK293／tau441細(xì)胞中PP-2A活性降低及其機(jī)制 PP-2A是調(diào)節(jié)tau蛋白磷酸化的關(guān)鍵的磷酸酯酶，通過γ~(32)P放射性同位素檢測了PP-2A的活性，發(fā)現(xiàn)PP-2A活性下降。 為了闡明蛋白酶小體抑制后是通過什么途徑來調(diào)節(jié)PP-2A的活性的，我們用lactacystin抑制蛋白酶小體的活性，并檢測PP-2A抑制劑1的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了PP-2A抑制劑1的表達(dá)明顯增加，這說明PP-2A抑制劑1也可能是通過蛋白酶小體來降解的，蛋白酶小體的活性下降導(dǎo)致了PP-2A抑制劑1表達(dá)增加，同時PP-2A抑制劑1作用于PP-2A引起了PP-2A的活性下降。 上述結(jié)果證明了抑制蛋白酶小體活性可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)tau蛋白聚積及其可能的機(jī)制。為了進(jìn)一步研究tau的磷酸化對蛋白酶小體活性的影響，我們將人最長tau異構(gòu)體(tau441)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞內(nèi)，用不同濃度的蛋白激酶A(PKA)的激活劑Forskolin處理細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)tau蛋白過度磷酸化，研究tau蛋白磷酸化對蛋白酶小體活性的影響。結(jié)果如下： 1．Forskolin誘導(dǎo)tau蛋白的過度磷酸化 我們首先用蛋白激酶PKA的激活劑forskolin作用于轉(zhuǎn)tau的HEK293細(xì)胞，并觀察細(xì)胞內(nèi)tau蛋白磷酸化狀態(tài)。通過Western blot對tau蛋白的不同磷酸化位點(PS262，PHF-1，Tau-1，PS262)檢測發(fā)現(xiàn)：細(xì)胞內(nèi)的tau蛋白隨forskolin(0.5μM，1μM，2μM，4μM)劑量增加而磷酸化的水平也增高，而細(xì)胞內(nèi)的總tau蛋白的量沒有明顯改變。 2．Forskolin誘導(dǎo)tau蛋白聚積 tau蛋白的過度磷酸化可能是導(dǎo)致其在HEK293／tau441細(xì)胞內(nèi)形成聚積體的原因。為了驗證這一想法，我們同時做了tau蛋白PS214位點的免疫熒光及thioflavin-S染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在對照組細(xì)胞內(nèi)，PS214的染色弱，thioflavin-S染色陽性的比率也小于5％。當(dāng)用2gM forskolin處理細(xì)胞后，PS214的染色明顯增加，thioflavin-S染色陽性的比率也有所增加(＞20％)，只是增加的程度遠(yuǎn)沒有磷酸化的程度強(qiáng)。疊加后顯示thioflavin-S染色陽性沉積遠(yuǎn)小于磷酸化的tau染色。用4μM forskolin處理HEK293／tau441發(fā)現(xiàn)PS214染色和21μM forskolin比僅有少許增加，而thioflavin-S陽性聚積體的形成則異常明顯(＞60％)。疊加后顯示出thioflavin-S染色陽性沉積和磷酸化的tau染色共定位于細(xì)胞內(nèi)，提示磷酸化的tau蛋白在細(xì)胞內(nèi)形成了廣泛的聚積體。 3．tau蛋白的磷酸化對蛋白酶小體的活性具有雙向調(diào)節(jié)作用 為了檢測tau蛋白的磷酸化水平對蛋白酶小體活性的影響，我們用Forskolin誘導(dǎo)tau的磷酸化，用熒光底物Boc-Leu-Ser-Thr-Arg-AMC檢測蛋白酶小體胰蛋白酶樣的活性，結(jié)果顯示較低程度的tau磷酸化可激活蛋白酶小體，而當(dāng)tau的磷酸化升高到一定程度時，則可明顯抑制其活性。該結(jié)果提示蛋白酶小體功能的抑制在AD的病變過程中可能是一個較晚的過程，可繼發(fā)于tau的異常過度磷酸化。 根據(jù)上述研究結(jié)果，我們得出如下結(jié)論：lactacystin抑制蛋白酶小體活性可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)tau蛋白含量增高；GSK-3的激活和PP-2A的抑制參與了磷酸化tau蛋白的聚積，且PP-2A活性的下調(diào)與PP-2A抑制劑1含量升高有關(guān)；一定程度過度磷酸化的tau蛋白呈雙向性調(diào)節(jié)(激活或抑制)蛋白酶小體活性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R363

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2280519