【摘要】： 第一部分運(yùn)用基因芯片技術(shù)研究hALR的免疫調(diào)控作用的分子機(jī)制 目的:肝再生增強(qiáng)因子(Augmenter of liver regeneration, ALR)是一種非特異性、具有熱穩(wěn)定性、不同于以往已知的促肝細(xì)胞增殖的肝細(xì)胞再生因子。因為它不僅通過直接刺激肝細(xì)胞增殖,而且可能還通過免疫調(diào)控作用參與損傷肝臟的修復(fù)。我們的前期研究已證明,ALR在體外能以劑量依賴方式抑制ConA刺激的大鼠T淋巴細(xì)胞增殖作用,并能抑制APC遞呈的特異性抗原刺激的T淋巴細(xì)胞的增殖,減少IL-2分泌。但目前對于ALR在免疫調(diào)節(jié)方面的分子作用機(jī)理還不十分明確。本實驗擬利用基因芯片這一高通量技術(shù),全面分析在hALR作用下ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞與單純經(jīng)ConA刺激的淋巴細(xì)胞的基因表達(dá)譜的差異,對所有表達(dá)的基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析,匯總整理出與hALR對ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖抑制作用相關(guān)的重要基因、分子功能和信號通路,為進(jìn)一步闡明ALR免疫調(diào)控作用的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 方法: 1.hALR的原核表達(dá)、純化及活性鑒定:復(fù)蘇含有pQE30-hALR的原核表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌SG13009,在異丙基-硫代-β-D-半乳糖苷(isopropyl-1-thio-β- D-galactoside, IPTG)誘導(dǎo)下進(jìn)行表達(dá),產(chǎn)物經(jīng)15% SDS-PAGE鑒定;用鎳離子親合層析柱(Ni-nitrilotriacetic acid resin, Ni-NTA )對表達(dá)產(chǎn)物hALR蛋白進(jìn)行純化,用15% SDS-PAGE鑒定。3H-TdR摻入法檢測hALR生物學(xué)活性。 2采集正常人外周靜脈血,分離人血單個核細(xì)胞(PBMC),并提取PBMC的總RNA。 3應(yīng)用Affymetrix公司的人類HG-U133A plus 2.0芯片分別對hALR刺激下ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞和單純經(jīng)ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞基因表達(dá)譜進(jìn)行全面分析。 4用RT-PCR方法對基因芯片檢測結(jié)果進(jìn)行驗證。 5應(yīng)用Microsoft Excel、GCOS(數(shù)據(jù)處理軟件)等軟件和相關(guān)網(wǎng)站對基因表達(dá)譜進(jìn)行差異分析,并進(jìn)行差異表達(dá)基因的Gene Ontology分類以及差異基因的Pathway分析 結(jié)果: 1、hALR在宿主菌SG13009中得到高效表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物分子量約為16KD,該蛋白經(jīng)親合層析純化后經(jīng)SDS-PAGE鑒定為單一條帶。3H-TdR摻入法檢測證實該蛋白能以劑量依賴方式刺激人肝癌細(xì)胞株QGY增殖。 2、對兩張基因芯片進(jìn)行差異分析后發(fā)現(xiàn):當(dāng)定義log2Ratio"g1時,上調(diào)基因有1422個,log2Ratio"f-1下調(diào)基因有1053個;log2Ratio"g2時,上調(diào)基因有257個,log2Ratio"f-2時下調(diào)基因有170個。 3、分別選擇上調(diào)基因SMAD3與下調(diào)基因B4GALT1經(jīng)半定量RT-PCR證實與基因芯片結(jié)果一致。 4、選擇500個上調(diào)及500個下調(diào)的基因進(jìn)行Pathway分析,這1000個基因參與了131個信號通路,如經(jīng)典的MAPK signaling pathway、JAK-STAT signaling pathway,Wnt signaling pathway, Apoptosis signaling pathway等。 結(jié)論 1、成功純化了原核表達(dá)的hALR蛋白,并對其進(jìn)行了生物學(xué)活性鑒定。 2、成功完成了hALR刺激下ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞與單純ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞基因表達(dá)譜差異分析。 3、經(jīng)pathway分析表明:參與的信號通路主要與增殖、生長、細(xì)胞凋亡等有關(guān)。主要的基因有Tp53,IL-1A, FAS,JunD, Bcl2, TNFRSF10A, MAP3K2等,這些基因也大多參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能。 4、基因芯片表達(dá)譜差異分析為信號通路中的相關(guān)基因和與之相聯(lián)系的基因進(jìn)行研究提供了可靠的依據(jù)。 第二部分MAPK信號通路與hALR抑制ConA誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖作用的關(guān)系 目的:前面的基因表達(dá)譜的差異分析研究提示:hALR對ConA誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用涉及到MAPK signaling pathway等多個信號通路途徑,MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是細(xì)胞外信號引起細(xì)胞核內(nèi)反應(yīng)的通道之一,可參與細(xì)胞的形成、運(yùn)動、凋亡、分化及生長增殖等多種生理過程,本實驗旨在探討MAPK signaling pathway在hALR對ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖抑制作用這一生物學(xué)過程中的作用。而基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵步驟在于轉(zhuǎn)錄起始部位,其中轉(zhuǎn)錄因子對眾多基因的表達(dá)起著極為重要的調(diào)控作用,是連接信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與基因表達(dá)的橋梁,本實驗選擇了與MAPK信號通路相關(guān)的三個重要轉(zhuǎn)錄因子AP-1,NFAT,SRE,分別運(yùn)用分泌型堿性磷酸酶報告基因瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù),研究這些與MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑密切相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子對hALR的反應(yīng),了解hALR對ConA誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用的作用機(jī)制。并用western blotting免疫印跡法對有顯著變化的轉(zhuǎn)錄因子上游磷酸化激酶的表達(dá)進(jìn)行驗證,以進(jìn)一步明確hALR的免疫調(diào)控機(jī)制。 方法: 1.hALR對ConA誘導(dǎo)的Jurkat T細(xì)胞作用的研究:選擇生長狀態(tài)良好的JurkatT細(xì)胞,給予ConA刺激,并于刺激后6h給予不同濃度的hALR,以3H-TdR摻入法檢測JurkatT細(xì)胞的增殖情況。 2.分泌型堿性磷酸酶(SEAP)報告質(zhì)粒擴(kuò)增,,酶切鑒定:分別將啟動子上游含有AP-1,NFAT,SRE的反應(yīng)元件)的分泌型堿性磷酸酶(SEAP)報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)入JM109大腸桿菌進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增,并小量抽提質(zhì)粒,進(jìn)行酶切鑒定。 3.分泌型堿性磷酸酶報告基因載體瞬時轉(zhuǎn)染及分泌型堿性磷酸酶的檢測:分別用GeneJuice脂質(zhì)體將pAP1-SEAP、pNFAT-SEAP、pSRE-SEAP、pTAL-SEAP(陰性對照質(zhì)粒),pSEAP2-control(陽性對照質(zhì)粒)瞬時轉(zhuǎn)染JurkatT細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后24h給予ConA刺激,轉(zhuǎn)染后30h給予hALR;分別于給予hALR后0h、6h、18h吸取上清液,運(yùn)用分泌型堿性磷酸酶檢測試劑盒進(jìn)行檢測,以測定相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性。 4.Western印跡法檢測AP1上游的關(guān)鍵激酶-磷酸化c-jun氨基端激酶(p-JNK)的表達(dá):選擇生長良好的JurkatT細(xì)胞,給予ConA刺激,并于刺激后6h給予hALR;加入hALR后0h,6h,12h分別取細(xì)胞液,提取細(xì)胞總蛋白,經(jīng)蛋白定量后用Western印跡法檢測c-jun氨基端激酶(p-JNK)的表達(dá)。 結(jié)果: hALR對ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖在20ul-100ul/ml濃度范圍內(nèi)有明顯抑制作用,且呈劑量依賴關(guān)系。 分泌型堿性磷酸酶(SEAP)報告質(zhì)粒經(jīng)擴(kuò)增后酶切鑒定結(jié)果與預(yù)期相符。 瞬時轉(zhuǎn)染分泌型堿性磷酸酶報告基因載體后,堿性磷酸酶的檢測結(jié)果提示:ConA刺激可使轉(zhuǎn)錄因子AP-1,NFAT,SRE轉(zhuǎn)錄活性均增高(P0.01);給予hALR刺激后,實驗組(ConA+hALR)與對照組(ConA)比較,僅AP-1轉(zhuǎn)錄活性在刺激后6h和18h均有增高(P0.01),而NFAT和SRE的轉(zhuǎn)錄活性均無顯著性差異(P0.05)。 Western印跡檢測AP1上游的關(guān)鍵激酶-磷酸化c-jun氨基端激酶(p-JNK)的表達(dá)結(jié)果顯示:單純在ConA刺激下,細(xì)胞均呈現(xiàn)明顯的p-JNK活性(P0.01));在hALR刺激下,ConA誘導(dǎo)的JurkatT細(xì)胞中p-JNK的表達(dá)水平在6h與12h,較單純ConA刺激組有明顯升高(p0.01);說明在hALR刺激下,p-JNK有過度表達(dá)。 結(jié)論: 驗證了hALR抑制ConA誘導(dǎo)的JurkatT淋巴細(xì)胞增殖作用,并確定了hALR對JurkatT細(xì)胞作用的最適濃度。 對分泌型堿性磷酸酶(SEAP)報告質(zhì)粒進(jìn)行了擴(kuò)增及酶切鑒定,為實驗提供了質(zhì)量可靠的質(zhì)粒。 hALR的刺激可使ConA誘導(dǎo)的JurkatT細(xì)胞中,磷酸化c-jun氨基端激酶(p-JNK)發(fā)生過度表達(dá),進(jìn)一步使其下游的轉(zhuǎn)錄因子AP-1轉(zhuǎn)錄活性增高。提示:hALR對ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖抑制作用可能與JNK/MAPK信號通路的過度激活引起細(xì)胞發(fā)生凋亡有密切關(guān)系。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R392

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