【摘要】： 第一部分運(yùn)用基因芯片技術(shù)研究hALR的免疫調(diào)控作用的分子機(jī)制 目的:肝再生增強(qiáng)因子(Augmenter of liver regeneration, ALR)是一種非特異性、具有熱穩(wěn)定性、不同于以往已知的促肝細(xì)胞增殖的肝細(xì)胞再生因子。因?yàn)樗粌H通過(guò)直接刺激肝細(xì)胞增殖,而且可能還通過(guò)免疫調(diào)控作用參與損傷肝臟的修復(fù)。我們的前期研究已證明,ALR在體外能以劑量依賴方式抑制ConA刺激的大鼠T淋巴細(xì)胞增殖作用,并能抑制APC遞呈的特異性抗原刺激的T淋巴細(xì)胞的增殖,減少IL-2分泌。但目前對(duì)于ALR在免疫調(diào)節(jié)方面的分子作用機(jī)理還不十分明確。本實(shí)驗(yàn)擬利用基因芯片這一高通量技術(shù),全面分析在hALR作用下ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞與單純經(jīng)ConA刺激的淋巴細(xì)胞的基因表達(dá)譜的差異,對(duì)所有表達(dá)的基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析,匯總整理出與hALR對(duì)ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖抑制作用相關(guān)的重要基因、分子功能和信號(hào)通路,為進(jìn)一步闡明ALR免疫調(diào)控作用的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 方法: 1.hALR的原核表達(dá)、純化及活性鑒定:復(fù)蘇含有pQE30-hALR的原核表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌SG13009,在異丙基-硫代-β-D-半乳糖苷(isopropyl-1-thio-β- D-galactoside, IPTG)誘導(dǎo)下進(jìn)行表達(dá),產(chǎn)物經(jīng)15% SDS-PAGE鑒定;用鎳離子親合層析柱(Ni-nitrilotriacetic acid resin, Ni-NTA )對(duì)表達(dá)產(chǎn)物hALR蛋白進(jìn)行純化,用15% SDS-PAGE鑒定。3H-TdR摻入法檢測(cè)hALR生物學(xué)活性。 2采集正常人外周靜脈血,分離人血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),并提取PBMC的總RNA。 3應(yīng)用Affymetrix公司的人類HG-U133A plus 2.0芯片分別對(duì)hALR刺激下ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞和單純經(jīng)ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞基因表達(dá)譜進(jìn)行全面分析。 4用RT-PCR方法對(duì)基因芯片檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。 5應(yīng)用Microsoft Excel、GCOS(數(shù)據(jù)處理軟件)等軟件和相關(guān)網(wǎng)站對(duì)基因表達(dá)譜進(jìn)行差異分析,并進(jìn)行差異表達(dá)基因的Gene Ontology分類以及差異基因的Pathway分析 結(jié)果: 1、hALR在宿主菌SG13009中得到高效表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物分子量約為16KD,該蛋白經(jīng)親合層析純化后經(jīng)SDS-PAGE鑒定為單一條帶。3H-TdR摻入法檢測(cè)證實(shí)該蛋白能以劑量依賴方式刺激人肝癌細(xì)胞株QGY增殖。 2、對(duì)兩張基因芯片進(jìn)行差異分析后發(fā)現(xiàn):當(dāng)定義log2Ratio"g1時(shí),上調(diào)基因有1422個(gè),log2Ratio"f-1下調(diào)基因有1053個(gè);log2Ratio"g2時(shí),上調(diào)基因有257個(gè),log2Ratio"f-2時(shí)下調(diào)基因有170個(gè)。 3、分別選擇上調(diào)基因SMAD3與下調(diào)基因B4GALT1經(jīng)半定量RT-PCR證實(shí)與基因芯片結(jié)果一致。 4、選擇500個(gè)上調(diào)及500個(gè)下調(diào)的基因進(jìn)行Pathway分析,這1000個(gè)基因參與了131個(gè)信號(hào)通路,如經(jīng)典的MAPK signaling pathway、JAK-STAT signaling pathway,Wnt signaling pathway, Apoptosis signaling pathway等。 結(jié)論 1、成功純化了原核表達(dá)的hALR蛋白,并對(duì)其進(jìn)行了生物學(xué)活性鑒定。 2、成功完成了hALR刺激下ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞與單純ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞基因表達(dá)譜差異分析。 3、經(jīng)pathway分析表明:參與的信號(hào)通路主要與增殖、生長(zhǎng)、細(xì)胞凋亡等有關(guān)。主要的基因有Tp53,IL-1A, FAS,JunD, Bcl2, TNFRSF10A, MAP3K2等,這些基因也大多參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能。 4、基因芯片表達(dá)譜差異分析為信號(hào)通路中的相關(guān)基因和與之相聯(lián)系的基因進(jìn)行研究提供了可靠的依據(jù)。 第二部分MAPK信號(hào)通路與hALR抑制ConA誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖作用的關(guān)系 目的:前面的基因表達(dá)譜的差異分析研究提示:hALR對(duì)ConA誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用涉及到MAPK signaling pathway等多個(gè)信號(hào)通路途徑,MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是細(xì)胞外信號(hào)引起細(xì)胞核內(nèi)反應(yīng)的通道之一,可參與細(xì)胞的形成、運(yùn)動(dòng)、凋亡、分化及生長(zhǎng)增殖等多種生理過(guò)程,本實(shí)驗(yàn)旨在探討MAPK signaling pathway在hALR對(duì)ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖抑制作用這一生物學(xué)過(guò)程中的作用。而基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵步驟在于轉(zhuǎn)錄起始部位,其中轉(zhuǎn)錄因子對(duì)眾多基因的表達(dá)起著極為重要的調(diào)控作用,是連接信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與基因表達(dá)的橋梁,本實(shí)驗(yàn)選擇了與MAPK信號(hào)通路相關(guān)的三個(gè)重要轉(zhuǎn)錄因子AP-1,NFAT,SRE,分別運(yùn)用分泌型堿性磷酸酶報(bào)告基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù),研究這些與MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑密切相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子對(duì)hALR的反應(yīng),了解hALR對(duì)ConA誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用的作用機(jī)制。并用western blotting免疫印跡法對(duì)有顯著變化的轉(zhuǎn)錄因子上游磷酸化激酶的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證,以進(jìn)一步明確hALR的免疫調(diào)控機(jī)制。 方法: 1.hALR對(duì)ConA誘導(dǎo)的Jurkat T細(xì)胞作用的研究:選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的JurkatT細(xì)胞,給予ConA刺激,并于刺激后6h給予不同濃度的hALR,以3H-TdR摻入法檢測(cè)JurkatT細(xì)胞的增殖情況。 2.分泌型堿性磷酸酶(SEAP)報(bào)告質(zhì)粒擴(kuò)增,,酶切鑒定:分別將啟動(dòng)子上游含有AP-1,NFAT,SRE的反應(yīng)元件)的分泌型堿性磷酸酶(SEAP)報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)入JM109大腸桿菌進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增,并小量抽提質(zhì)粒,進(jìn)行酶切鑒定。 3.分泌型堿性磷酸酶報(bào)告基因載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及分泌型堿性磷酸酶的檢測(cè):分別用GeneJuice脂質(zhì)體將pAP1-SEAP、pNFAT-SEAP、pSRE-SEAP、pTAL-SEAP(陰性對(duì)照質(zhì)粒),pSEAP2-control(陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染JurkatT細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后24h給予ConA刺激,轉(zhuǎn)染后30h給予hALR;分別于給予hALR后0h、6h、18h吸取上清液,運(yùn)用分泌型堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè),以測(cè)定相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性。 4.Western印跡法檢測(cè)AP1上游的關(guān)鍵激酶-磷酸化c-jun氨基端激酶(p-JNK)的表達(dá):選擇生長(zhǎng)良好的JurkatT細(xì)胞,給予ConA刺激,并于刺激后6h給予hALR;加入hALR后0h,6h,12h分別取細(xì)胞液,提取細(xì)胞總蛋白,經(jīng)蛋白定量后用Western印跡法檢測(cè)c-jun氨基端激酶(p-JNK)的表達(dá)。 結(jié)果: hALR對(duì)ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖在20ul-100ul/ml濃度范圍內(nèi)有明顯抑制作用,且呈劑量依賴關(guān)系。 分泌型堿性磷酸酶(SEAP)報(bào)告質(zhì)粒經(jīng)擴(kuò)增后酶切鑒定結(jié)果與預(yù)期相符。 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染分泌型堿性磷酸酶報(bào)告基因載體后,堿性磷酸酶的檢測(cè)結(jié)果提示:ConA刺激可使轉(zhuǎn)錄因子AP-1,NFAT,SRE轉(zhuǎn)錄活性均增高(P0.01);給予hALR刺激后,實(shí)驗(yàn)組(ConA+hALR)與對(duì)照組(ConA)比較,僅AP-1轉(zhuǎn)錄活性在刺激后6h和18h均有增高(P0.01),而NFAT和SRE的轉(zhuǎn)錄活性均無(wú)顯著性差異(P0.05)。 Western印跡檢測(cè)AP1上游的關(guān)鍵激酶-磷酸化c-jun氨基端激酶(p-JNK)的表達(dá)結(jié)果顯示:單純?cè)贑onA刺激下,細(xì)胞均呈現(xiàn)明顯的p-JNK活性(P0.01));在hALR刺激下,ConA誘導(dǎo)的JurkatT細(xì)胞中p-JNK的表達(dá)水平在6h與12h,較單純ConA刺激組有明顯升高(p0.01);說(shuō)明在hALR刺激下,p-JNK有過(guò)度表達(dá)。 結(jié)論: 驗(yàn)證了hALR抑制ConA誘導(dǎo)的JurkatT淋巴細(xì)胞增殖作用,并確定了hALR對(duì)JurkatT細(xì)胞作用的最適濃度。 對(duì)分泌型堿性磷酸酶(SEAP)報(bào)告質(zhì)粒進(jìn)行了擴(kuò)增及酶切鑒定,為實(shí)驗(yàn)提供了質(zhì)量可靠的質(zhì)粒。 hALR的刺激可使ConA誘導(dǎo)的JurkatT細(xì)胞中,磷酸化c-jun氨基端激酶(p-JNK)發(fā)生過(guò)度表達(dá),進(jìn)一步使其下游的轉(zhuǎn)錄因子AP-1轉(zhuǎn)錄活性增高。提示:hALR對(duì)ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖抑制作用可能與JNK/MAPK信號(hào)通路的過(guò)度激活引起細(xì)胞發(fā)生凋亡有密切關(guān)系。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R392

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 宋軍澎;趙繼學(xué);高虹;劉妍;岳紅霞;張靜;蘇艷;尹繼剛;;長(zhǎng)春地區(qū)醫(yī)院就診患者隱孢子蟲(chóng)感染的血清學(xué)檢測(cè)[J];中國(guó)寄生蟲(chóng)學(xué)與寄生蟲(chóng)病雜志;2011年03期

2 林瑛;周倩;荀啟靜;孟清;;高剪接活性斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的體內(nèi)切割[J];中國(guó)生物工程雜志;2011年08期

3 ;[J];;年期

4 ;[J];;年期

5 ;[J];;年期

6 ;[J];;年期

7 ;[J];;年期

8 ;[J];;年期

9 ;[J];;年期

10 ;[J];;年期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 王曉東;林鐲;張友才;陳永平;許爛漫;陳國(guó)榮;鞏躍文;;大鼠肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子與肝再生增強(qiáng)因子融合基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定[A];第十八次全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合肝病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2009年

2 李正;黃林;楊寒朔;胡火珍;;AK078438基因的克隆、蛋白質(zhì)純化及其在小鼠中表達(dá)和功能的初步研究[A];中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)第九次會(huì)員代表大會(huì)暨青年學(xué)術(shù)大會(huì)論文摘要集[C];2007年

3 孔毅;;一種新的尖吻腹蛇毒類凝血酶的純化及性質(zhì)研究[A];第一屆全國(guó)化學(xué)工程與生物化工年會(huì)論文摘要集(下)[C];2004年

4 ;遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室簡(jiǎn)介[A];培育生物產(chǎn)業(yè)，發(fā)展綠色經(jīng)濟(jì)——第五屆中國(guó)生物產(chǎn)業(yè)大會(huì)·2011基因科學(xué)與產(chǎn)業(yè)發(fā)展論壇會(huì)刊[C];2011年

5 劉俊果;邢建民;馬志亞;陽(yáng)承利;劉會(huì)洲;;反膠團(tuán)分離純化納豆激酶:從模擬體系到實(shí)際體系[A];第一屆全國(guó)化學(xué)工程與生物化工年會(huì)論文摘要集(下)[C];2004年

6 柳學(xué)廣;徐世清;司馬楊虎;吳陽(yáng)春;劉瑩;叢海峰;王玉軍;;家蠶滯育生物鐘蛋白質(zhì)基因ea4的cDNA序列分析[A];2006全國(guó)時(shí)間生物醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2006年

7 陳培君;王曉杜;羅金燕;劉超;沈陽(yáng);邱亞峰;李向東;王豪舉;馬志永;;豬流感病毒H3N2亞型PB1-F2蛋白的原核表達(dá)[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2009學(xué)術(shù)年會(huì)論文集（下冊(cè)）[C];2009年

8 王曉東;林鐲;張友才;陳永平;許爛漫;;大鼠肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子與肝再生增強(qiáng)因子融合基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定[A];第二十次全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合肝病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2011年

9 李春海;;蛋白質(zhì)組學(xué)在臨床醫(yī)學(xué)中應(yīng)用與研究進(jìn)展[A];第三屆“分子核醫(yī)學(xué)在腫瘤診斷與治療中的應(yīng)用與研究進(jìn)展”全國(guó)腫瘤分子標(biāo)志的研究與方法學(xué)進(jìn)展學(xué)術(shù)交流會(huì)資料匯編[C];2006年

10 徐頻;吳自榮;;枯草桿菌信號(hào)肽結(jié)構(gòu)和功能的研究[A];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì)第八屆會(huì)員代表大會(huì)暨全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2001年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 本報(bào)記者　 周清春;見(jiàn)證蛋白質(zhì)的“誕生”[N];科技日?qǐng)?bào);2006年

2 《科學(xué)美國(guó)人》中文版《科學(xué)》;蛋白質(zhì)統(tǒng)治時(shí)代[N];科技日?qǐng)?bào);2002年

3 駐滬記者　 張莉;GE將為中國(guó)生物制藥企業(yè)做技術(shù)外包[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2006年

4 王雪飛 肖鑫 丁繼東 吳偉華 湯宏 車夫;青春，在不斷創(chuàng)新中勃發(fā)[N];健康報(bào);2005年

5 本報(bào)記者　樸淑瑜　唐婷;全天候、全開(kāi)放為生命科學(xué)研究服務(wù)[N];科技日?qǐng)?bào);2007年

6 記者馮國(guó)梧;天士力巨資買斷國(guó)家生物一類新藥[N];科技日?qǐng)?bào);2002年

7 史鳳芝;肝硬化終遇“殺手”[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2001年

8 王海峰;醫(yī)藥精化企業(yè)苦練降本功[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2006年

9 記者 邢曉丹;南海水產(chǎn)研究所添置新設(shè)備[N];政府采購(gòu)信息報(bào);2008年

10 秦建成;恩度：誕生世界首例餓死腫瘤新藥[N];中國(guó)國(guó)門(mén)時(shí)報(bào);2009年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 陳曜;hALR抑制ConA誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖作用的分子機(jī)制研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2007年

2 唐琳;肝再生增強(qiáng)因子與肝癌發(fā)生、發(fā)展關(guān)系的研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2005年

3 李青;肝再生增強(qiáng)因子重組質(zhì)粒在大鼠肝組織中的表達(dá)及其抗實(shí)驗(yàn)性肝纖維化的作用研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2005年

4 黃圣兵;大鼠肝線粒體膽堿脫氫酶與電子傳遞黃素蛋白—泛醌氧化還原酶的研究[D];中國(guó)科學(xué)院研究生院（上海生命科學(xué)研究院）;2003年

5 秦云;基因工程重組人骨形成蛋白2及4的制備及懸吊大鼠四肢骨中骨形成蛋白2表達(dá)的變化[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2005年

6 周靈德;鈣磷降解材料生物礦化的細(xì)胞分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究[D];武漢理工大學(xué);2006年

7 劉鴻凌;人肝細(xì)胞型體外生物人工肝支持系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)研究[D];中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2009年

8 胡春光;新型人胚胎肝源性因子的提純與鑒定[D];吉林大學(xué);2004年

9 潘艷;人肝再生增強(qiáng)因子結(jié)構(gòu)與功能的初步研究[D];吉林大學(xué);2007年

10 王文龍;Hypodermins A，B，，C基因cDNA在大腸桿菌中的表達(dá)及牛皮蠅蛆病ELISA診斷方法的建立[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 翟曉亮;基于數(shù)據(jù)挖掘的蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)研究[D];大連理工大學(xué);2011年

2 周雪瑩;人扭轉(zhuǎn)蛋白A的基因克隆表達(dá)及蛋白質(zhì)純化[D];中國(guó)海洋大學(xué);2005年

3 周飛;肝再生增強(qiáng)因子干預(yù)腎小管上皮細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制探討[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2007年

4 劉瑩;類人彈性蛋白多肽基因表達(dá)條件的優(yōu)化和純化[D];西北大學(xué);2011年

5 陳思強(qiáng);應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選hALR的相互作用蛋白[D];華南理工大學(xué);2003年

6 王允;人肺腺癌細(xì)胞株A549中熱休克蛋白70的分離及純化[D];鄭州大學(xué);2006年

7 嚴(yán)興;重組人源性抗HBsAg單鏈抗體在大腸桿菌中的表達(dá)、純化與活性鑒定[D];華南理工大學(xué);2002年

8 張妍;HCMV致嬰兒肝炎綜合征的血清蛋白標(biāo)志物研究[D];青島大學(xué);2006年

9 張勇;肝再生增強(qiáng)因子促進(jìn)肝再生的信號(hào)途徑研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2006年

10 龍飛伍;肝再生增強(qiáng)因子與大鼠原位肝移植急性排斥反應(yīng)相關(guān)性作用研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2008年

本文編號(hào)：2280268