【摘要】： 胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)衍生自植入前囊胚內(nèi)細胞團(inner mass cells，ICM)或原始生殖細胞(primordial germ cells，PGCs)，在體外進行培養(yǎng)傳代能夠保持未分化狀態(tài)，且能維持正常的二倍體染色體結(jié)構(gòu)，具有分化發(fā)育成三個胚層組織細胞潛能的全能性細胞。將人胚胎干細胞進行定向誘導(dǎo)分化成人體體細胞可用于細胞或組織器官的移植，同時胚胎干細胞的發(fā)現(xiàn)還為研究細胞分化，物種發(fā)育機制，闡明基因功能，篩選藥物等開辟了廣闊的空間。因此人胚胎干細胞相關(guān)研究成為世界各個研究領(lǐng)域的熱點而備受矚目。但至今人胚胎干細胞仍缺乏高效、穩(wěn)定的建系方法，體外培養(yǎng)條件苛刻，容易自發(fā)分化，這些都阻礙了人胚胎干細胞研究與應(yīng)用的腳步。人胚胎干細胞建系的關(guān)鍵在于：①狀態(tài)穩(wěn)定良好的飼養(yǎng)層細胞；②質(zhì)量良好的囊胚；③可靠、穩(wěn)定的培養(yǎng)方法；④有效的內(nèi)細胞團分離；⑤可靠、有效的傳代。根據(jù)抑制細胞分化因子的來源不同分為飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系和無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系，目前已有研究證實人胚胎干細胞的培養(yǎng)有賴于飼養(yǎng)層體系；建系過程中常用的培養(yǎng)方法有全胚培養(yǎng)法和免疫外科法，兩種方法均有建系成功的報道，而何種更優(yōu)仍無定論；在使用免疫囊胚刀分離內(nèi)細胞團的過程中，何種濃度的抗體與補體能夠高效分離內(nèi)細胞團；在原代克隆接種后，適時的進行傳代可保證其最大增殖同時不發(fā)生自發(fā)分化，擬通過檢測體外培養(yǎng)不同天數(shù)ICM ES樣標記表達情況摸索適時的離散時機。本研究在前期鼠胚胎干細胞建系的基礎(chǔ)上，利用本中心新鮮廢棄胚胎，從囊胚質(zhì)量與結(jié)局的關(guān)系，兩種不同培養(yǎng)方法，有效分離內(nèi)細胞團的方法和最佳傳代時機等四個方面，對影響成功建系的因素進行分析，探尋可靠、高效建立人胚胎干細胞的方法，為最終成功建立人胚胎干細胞系提供方法指導(dǎo)和理論依據(jù)。 方法 1、取孕12.5—14.5天昆明小鼠的胎鼠，制作鼠成纖維細胞飼養(yǎng)層。 2、收集本中心2005年5月至2007年1月間進行的IVF-ET周期新鮮廢棄胚胎，培養(yǎng)至囊胚并評分。所有用于研究的胚胎均經(jīng)患者知情同意。 3、囊胚隨機分為兩組，一組去透明帶后直接置于飼養(yǎng)層進行全胚培養(yǎng)；另一組使用免疫外科法分離ICM后再接種于飼養(yǎng)層培養(yǎng)。記錄每個囊胚貼壁、原代克隆形成及傳代情況。 4、免疫外科法分離ICM時囊胚置于四組不同濃度的兔抗人血清和新鮮豚鼠血清中，觀察滋養(yǎng)外胚層去除和ICM完整情況。 5、免疫法分離出ICM置于ES培養(yǎng)微滴中培養(yǎng)，隔日換液，分別于培養(yǎng)D5、D6、D7、D8、D9、D10、D11、D12分別用染料著色方法檢測ICM ES樣標記堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)活性和細胞免疫熒光法檢測胚胎表面階段特異性標記4(stage specific embryonic antigen 4，SSEA-4)的表達情況。 結(jié)果 1、胚胎收集及培養(yǎng)情況 本實驗共收集D3新鮮廢棄胚胎共257枚，體外培養(yǎng)后102枚發(fā)育至囊胚，囊胚形成率為39.7％，其中用于建系的3-4AA級／3-4BA級囊胚13枚，3-4AB級／3-4BB級23枚，3CC級15枚。余51枚用于檢測培養(yǎng)不同天數(shù)ICM ES樣標記表達情況。 2、囊胚質(zhì)量與結(jié)局 3-4AA級／3-4BA級囊胚：13枚，接種12枚，貼壁11枚，貼壁率為91.7％，形成典型克隆4個，克隆形成率為33.3％，可傳代2個，傳代率16.7％。 3-4AB級／3-4BB級囊胚：23枚，接種20枚，貼壁14枚，貼壁率為70％，形成典型克隆5個，克隆形成率為25％，可傳代1個，傳代率5％。 3CC級囊胚：15枚，接種5枚，貼壁0枚，形成克隆0個，傳代0個。 3-4AA級／3-4BA級和3-4AB級／3-4BB級囊胚各項指標均高于3CC級，3-4AA級／3-4BA級囊胚傳代率高于3-4AB級／3-4BB級囊胚，P＜0.05，而貼壁率和原代克隆形成率無統(tǒng)計學(xué)差異，P＞0.05。 3、不同培養(yǎng)方法對原代克隆生長的影響 全胚培養(yǎng)法：囊胚19枚，貼壁10個，貼壁率為52.6％，形成典型的原代克隆3個，克隆形成率為15.8％，均為能傳代。 免疫外科法：囊胚32個，，分離出完整的進行接種ICM18個，貼壁15個，貼壁率為83.3％，形成典型的原代克隆6個，克隆形成率為33.3％，其中三個傳至3代，停止增殖，未能建系。 兩種培養(yǎng)方法比較，免疫外科法組的貼壁率、克隆形成率及傳代數(shù)均高于全胚培養(yǎng)法組，P＜0.05。 4、不同濃度血清免疫法分離ICM比較 1：8兔抗人血清+1：8新鮮豚鼠血清：滋養(yǎng)外胚層細胞無明顯改變，完全不能去除。 1：4兔抗人血清+1：4新鮮豚鼠血清：滋養(yǎng)外胚層細胞少量細胞腫脹，去除不完全。 1：2兔抗人血清+1：2新鮮豚鼠血清：外滋養(yǎng)細胞與內(nèi)細胞團全部溶解。 1：2兔抗人血清+1：4新鮮豚鼠血清：外滋養(yǎng)細胞腫脹，去除完全，內(nèi)細胞團完整。 5、體外培養(yǎng)不同天數(shù)ICM AKP活性和SSEA-4表達情況 AKP活性：體外培養(yǎng)至D5、D6、D7 ICM著色后為藍紫色，呈陽性(+)表達；D8、D9、D10著色漸淡，部分區(qū)域不著色，呈弱陽性(±)；D11、D12 ICM完全不著色，呈陰性(-)。 SSEA-4：體外培養(yǎng)至D5、D6、D7、D8 ICM熒光顯微鏡下觀察可見細胞團發(fā)出綠色熒光，呈陽性(+)表達；D9、D10綠色熒光漸暗，呈弱陽性(±)；D11、D12 ICM不再有熒光，鏡下僅見細胞間界限明顯的細胞團，SSEA-4表達呈陰性(-)。 結(jié)論 1、原代建系建議使用3BB級以上的囊胚。質(zhì)量差的囊胚，細胞數(shù)目少、增殖能力差，不能進行有效的擴增傳代。 2、免疫外科法在分離ICM的同時也是對質(zhì)量差的胚胎的淘汰，去除滋養(yǎng)外胚層減少了外滋養(yǎng)細胞與內(nèi)細胞團共培養(yǎng)對其產(chǎn)生的誘導(dǎo)分化作用，從而提高貼壁率和原代克隆形成率，是一種更為高效的原代培養(yǎng)方法。 3、免疫囊胚刀采用1：2倍比稀釋的兔抗人血清和1：4倍比稀釋的新鮮豚鼠血清可在有效去除滋養(yǎng)外胚層細胞的同時保證內(nèi)細胞團的完整性。 4、在保證細胞最大的增殖的條件下，ES樣克隆離散的時機應(yīng)選擇在接種培養(yǎng)后7-10天，最長不可超過10天，以避免細胞發(fā)生自發(fā)分化。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R329

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 從玉華;;從皮膚中提取干細胞[J];中學(xué)生優(yōu)秀作文(中考專刊);2009年10期

2 薛俠;趙皖秋;張四林;秦臻;師娟子;;人胚胎移植后剩余胚胎繼續(xù)體外培養(yǎng)潛能的研究[J];實用臨床醫(yī)藥雜志;2011年13期

3 ;國際舞臺上中國干細胞研究專家2010年4～5月的成果[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2011年27期

4 朋客;;拋棄男人孕育生命?[J];生命世界;2006年10期

5 徐紅新;田毅浩;曲折;黃文蔚;蔣學(xué)俊;李庚山;;激活Notch對胚胎干細胞向心肌細胞分化的影響[J];武漢大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2011年05期

6 郭禮和;;人羊膜上皮細胞具有胚胎干細胞和移植免疫耐受等優(yōu)良特性[J];中國細胞生物學(xué)學(xué)報;2011年04期

7 ;國際舞臺上中國干細胞研究專家2010年1～2月的學(xué)術(shù)成果[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2011年23期

8 張樹庸;;科學(xué)家確定DNA的第7種和第8種堿基[J];實驗動物科學(xué);2011年04期

9 ;“人造精子”獲重大突破[J];戀愛婚姻家庭(養(yǎng)生);2011年10期

10 ;國際舞臺上中國干細胞研究專家2010年6～7月的成果[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2011年32期

相關(guān)會議論文 前10條

1 傅文慶;;開發(fā)去老化技術(shù)學(xué)的前景論證[A];老齡問題研究論文集（十一）——積極老齡化研究之三[C];2006年

2 秦茂林;蔡文琴;張吉強;李成仁;李巍;;雌二醇對胚胎干細胞神經(jīng)定向分化誘導(dǎo)的影響[A];中國解剖學(xué)會第十一屆全國組織學(xué)與胚胎學(xué)青年學(xué)術(shù)研討會論文匯編[C];2009年

3 徐小明;竇忠英;華進聯(lián);葛秀國;;免疫外科法分離克隆BALB/c小鼠胚胎干細胞[A];全國首屆動物生物技術(shù)學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2004年

4 蔣暉;瞿東濱;金大地;鞠躬;;新型神經(jīng)營養(yǎng)因子TAT-BDNF促進胚胎干細胞的神經(jīng)元性分化[A];第一屆全國脊髓損傷治療與康復(fù)研討會暨中國康復(fù)醫(yī)學(xué)會脊柱脊髓損傷專業(yè)委員會脊髓損傷與康復(fù)學(xué)組成立會論文匯編[C];2009年

5 于洲;徐海濱;;應(yīng)用胚胎干細胞實驗?zāi)Ｐ腕w系對異硫氰酸鹽發(fā)育毒性的研究[A];2010年全國藥物毒理學(xué)學(xué)術(shù)會議論文集[C];2010年

6 劉平;關(guān)云謙;鄒春林;張愚;陳彪;劉焯霖;;胚胎干細胞在體內(nèi)外誘導(dǎo)分化成為多巴胺能神經(jīng)的初步研究[A];中華醫(yī)學(xué)會第七次全國神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2004年

7 隋婧;姜方旭;施秉銀;;胚胎干細胞定向分化為胰島祖細胞的基因表達譜分析[A];中華醫(yī)學(xué)會第十次全國內(nèi)分泌學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2011年

8 胡敏華;區(qū)穎蕾;李莉;郭欣政;張守全;;胚胎干細胞飼養(yǎng)層的優(yōu)化及影響內(nèi)細胞團貼壁率的探討[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物繁殖學(xué)分會第十五屆學(xué)術(shù)研討會論文集（上冊）[C];2010年

9 馬育芳;楊陽;李燕;王少華;趙蕊;李寧;;豬胚胎干細胞多能性因子Nanog對胚胎發(fā)育的影響[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物繁殖學(xué)分會第十五屆學(xué)術(shù)研討會論文集（上冊）[C];2010年

10 曹楠;楊黃恬;;大鼠胚胎干細胞向心肌細胞體外分化的研究[A];中國病理生理學(xué)會第九屆全國代表大會及學(xué)術(shù)會議論文摘要[C];2010年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 張樹庸　趙貴英;干細胞研究的突破[N];人民日報;2009年

2 記者 鄭曉春;胚胎干細胞療法安全性研究亟待加強[N];科技日報;2009年

3 記者 余靖靜;我科學(xué)家實現(xiàn)“用胚胎干細胞再生肌腱”[N];新華每日電訊;2009年

4 本報記者 李雪林;如何讓中國小實驗室厚積薄發(fā)[N];文匯報;2009年

5 記者孫國根;首個大鼠胚胎干細胞成功提取[N];健康報;2009年

6 孫國根;復(fù)旦大學(xué)成功提取首個大鼠胚胎干細胞[N];中國醫(yī)藥報;2009年

7 本報首席記者 任荃;第二顆“全能種子”會不會搶先“發(fā)芽”[N];文匯報;2009年

8 記者 鄭曉春;懸浮液可用于大規(guī)模培育胚胎干細胞[N];科技日報;2010年

9 記者 錢錚;牛膠原蛋白可助降低胚胎干細胞癌變幾率[N];新華每日電訊;2009年

10 記者 任海軍;奧兌現(xiàn)承諾,但“松綁”效應(yīng)不會立竿見影[N];新華每日電訊;2009年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 譚舟;MK和GM-CSFRα在胚胎干細胞中的表達與功能研究[D];浙江大學(xué);2010年

2 蘇中淵;胚胎干細胞來源的間充質(zhì)干細胞歸巢及胚胎干細胞表面分子的研究[D];浙江大學(xué);2010年

3 廖宏慶;人類不同原核數(shù)目受精卵中篩選正常優(yōu)質(zhì)胚胎的策略研究[D];中南大學(xué);2010年

4 白春玲;牛孤雌多倍體胚胎與克隆多倍體胚胎的研究[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2011年

5 曲文玉;人胚胎干細胞的分離、培養(yǎng)及建系[D];中國醫(yī)科大學(xué);2006年

6 李相運;小鼠胚胎干細胞多能性研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2001年

7 姚嘉宜;胚胎干細胞重新編程腫瘤細胞的研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2008年

8 趙惠萍;骨髓內(nèi)皮細胞條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)胚胎干細胞向造血細胞分化[D];中南大學(xué);2003年

9 劉星霞;胚胎干細胞ES-D_3誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細胞及其對糖尿病鼠降糖作用的研究[D];山東大學(xué);2005年

10 諶兵來;小鼠胚胎干細胞建系新方法及TFAG促進鼠胚胎干細胞向神經(jīng)細胞分化的初步研究[D];中南大學(xué);2003年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 孫國杰;山羊類胚胎干細胞的分離、克隆[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2002年

2 呂一帆;胚胎干細胞在內(nèi)膜損傷小鼠宮腔內(nèi)移植的實驗研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2010年

3 關(guān)秀文;葛根素對小鼠D3胚胎干細胞的肝細胞定向分化能力的影響及其機制[D];華中科技大學(xué);2010年

4 周文平;小鼠三種胚胎干細胞表觀相關(guān)基因的分析[D];河南大學(xué);2011年

5 姜靜宜;胚胎干細胞中外源性IbeB靶蛋白的篩選及驗證[D];中國醫(yī)科大學(xué);2010年

6 蔡斌;體外誘導(dǎo)胚胎干細胞為神經(jīng)細胞模型的建立及相關(guān)因子的實驗研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2001年

7 顧文佳;誘導(dǎo)胚胎干細胞向神經(jīng)細胞分化的研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2004年

8 李宏圖;RNAi誘導(dǎo)小鼠ES細胞向神經(jīng)細胞分化的研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2006年

9 張曉進;小鼠核移植胚胎干細胞系的建立及其全能性檢測[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2007年

10 李娜;堿性成纖維細胞生長因子對胚胎干細胞來源暴式集落形成細胞形成的作用及其機制研究[D];濱州醫(yī)學(xué)院;2010年

本文編號：2275174