發(fā)布時間：2018-10-11 13:47

【摘要】： 實驗?zāi)康?系統(tǒng)性結(jié)締組織病(connective tissue disease，，CTD)如系統(tǒng)性硬化癥(systemic sclerosis，SSc)、混合結(jié)締組織病(mixed connective tissue disease，MCTD)、多發(fā)性肌炎(polymyositis，PM)以及系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)等常伴發(fā)肺血管病變，部分可最終導(dǎo)致肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)。合并PAH的CTD患者預(yù)后極差，以SLE、SSc及PM混合出現(xiàn)為特點的MCTD患者中，幾近半數(shù)死因要歸于PAH。然而，系統(tǒng)性CTD患者發(fā)生肺血管損傷的相關(guān)機制目前尚不十分清楚。 小核核糖體蛋白(small nuclear ribonucleoproteins，snRNPs)是一組由小RNA及其相連多肽組成的核糖體蛋白顆粒，彌漫散在地分布于細胞核質(zhì)內(nèi)，主要參與前mRNA的剪切過程。CTD患者血清中常可檢出抗snRNPs自身抗體。snRNPs包括多種抗原如U1、U2、U5、U4／U6等，其中含量最豐富的是U1RNP。絕大多數(shù)snRNPs都包含一種SmRNP核心結(jié)構(gòu)，通過免疫沉降法可沉淀出所有含Sm核心結(jié)構(gòu)的RNP抗原�？筓1RNP抗體陽性是MCTD的診斷依據(jù)之一，MCTD患者血清抗U1RNP抗體滴度明顯升高�？筓1RNP抗體陽性的MCTD患者PAH的發(fā)生率較高，PAH是抗U1RNP抗體陽性患者預(yù)后不良的重要危險因素。研究表明，抗U1RNP抗體可上調(diào)人類肺動脈內(nèi)皮細胞(human pulmonary artery endothelial cell，HPAEC)表達細胞間粘附分子-1(intercellular cell adhension molecule-1，ICAM-1)、內(nèi)皮細胞白細胞粘附分子-1(endothelial leucocyte adhesion molecule-1，ELAM-1)以及MHCⅡ類分子，通過免疫反應(yīng)參與肺動脈血管病變的形成�？筓1RNP抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，可最終導(dǎo)致CTD患者出現(xiàn)PAH。 抗U1RNP抗體與CTD患者的PAH的形成有關(guān)，但不是唯一因素。研究顯示，除外抗U1RNP抗體，其它抗原特異性自身抗體如抗內(nèi)皮細胞抗體(anti-endothelial cell antibody，AECA)在PAH的發(fā)生、發(fā)展過程中也發(fā)揮一定作用。臨床上大多數(shù)MCTD患者并不合并PAH，反之，許多合并PAH的CTD患者的血清中亦不存在抗U1RNP抗體。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在系統(tǒng)性自身免疫疾病患者的血清中�？蓹z出AECA，并顯示AECA與動脈血管內(nèi)皮損傷有關(guān)。因此，我們推測CTD患者外周血中，存在特異性抗HPAEC自身抗體，它們不同于抗RNP抗體等抗核抗體，可特異性地與HPAEC抗原結(jié)合，通過自身免疫性炎癥反應(yīng)參與肺動脈血管損傷及PAH形成。這種特定部位抗原抗體反應(yīng)所致的肺動脈血管內(nèi)皮炎癥可能是CTD患者發(fā)生PAH的機制之一。AECA同HPAEC抗原表位結(jié)合后，可能作為刺激信號改變HPAEC的功能狀態(tài)。有資料證實，AECA可上調(diào)內(nèi)皮細胞E-選擇素、ICAM-1及VCAM-1的表達，誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞分泌白介素-1β(imerleukin-1β，IL-1β)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)和白介素-8(interleukin-6，IL-8)；還可活化血管內(nèi)皮細胞，產(chǎn)生白細胞趨化因子如RANTES(Regulated Upon Activation，Normal T-cell Expressed and Secreted，活化T細胞調(diào)節(jié)的正常T細胞表達和分泌的因子)及淋巴細胞活化共刺激分子。RANTES是單核細胞及T細胞的重要趨化因子，具有控制單核細胞和淋巴細胞定向遷移的免疫學(xué)特性，通過促進白細胞募集、粘附以及內(nèi)皮細胞活化誘發(fā)炎癥反應(yīng)，造成血管內(nèi)皮損傷。PAH患者肺組織原位雜交及免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細胞是RANTES的主要來源，PAH患者肺組織中RANTES mRNA水平明顯升高。另外，RANTES通過間接誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)換酶-1和內(nèi)皮素-1的產(chǎn)生，促進PAH形成。 目前，關(guān)于MCTD患者PAH發(fā)病機理的研究逐漸增多，但自身抗體介導(dǎo)的肺動脈血管損傷機制以及HPAEC本身在血管損傷過程中的作用仍不清楚。我們推測，抗HPAEC自身抗體在系統(tǒng)性自身免疫疾病患者PAH發(fā)生中起一定作用，HPAEC本身可能也參與血管炎的發(fā)生。臨床抗U1RNP抗體陽性患者肺損傷多見，且有研究顯示抗U1RNP抗體與肺血管內(nèi)皮損傷相關(guān)，本研究選擇抗U1RNP抗體陽性血清作為研究對象，檢測血清特異性抗HPAEC抗體，探討該抗體同抗U1RNP抗體之間的關(guān)聯(lián)性，并觀察其對HPAEC分泌RANTES的影響，在此基礎(chǔ)上分析抗HPAEC抗體在肺動脈血管免疫損傷中的作用，以期闡明CTD患者PAH的發(fā)病機制，為更有效臨床治療藥物的研制開發(fā)提供新的理論和實驗依據(jù)。 實驗方法 一、RNA-免疫沉降法(RNA-IPP)篩選抗U1RNP抗體陽性血清 2mg sepharose CL-4B蛋白A與500μl IPP緩沖液均勻混合后，加入10μl患者血清，4℃翻轉(zhuǎn)混合2h。血清抗體包被的cepharose顆粒用500μl IPP緩沖液沖洗3次后與細胞抗原反應(yīng)，抗原用Hela細胞制備(每個標本6×10~6個細胞)。HeLa細胞加入0.3ml NET-2緩沖液中，經(jīng)超聲裂解后，收集細胞裂解液上清，加入400μl NET-2緩沖液，其中含有抗體包被的cephalose顆粒，4℃孵育2h。反應(yīng)后的顆粒，經(jīng)NET-2緩沖液洗滌3次并離心后，加入270μl NET-2緩沖液，30μl 3M醋酸鈉溶液，15μl 20％SDS溶液，其中RNA經(jīng)phenol／chloroform／isoamyl alcohol(50：50：1)提取后用3倍體積的乙醇沉淀析出后，經(jīng)10％聚丙烯酰胺-7M尿素凝膠電泳分離，最后通過銀染色顯影。 二、蛋白質(zhì)免疫印記雜交檢測血清特異性抗HPAEC抗體 (一)細胞抗原的制備 HPAEC購自日本KURABO公司，經(jīng)血管內(nèi)皮細胞專用培養(yǎng)基(HuMedia-EG2)培養(yǎng)。使用前細胞用Trypsin／EDTA溶液自細胞培養(yǎng)瓶分離，中和液中和，PBS洗滌3次。HPAEC經(jīng)細胞裂解液(10mM Tris-Hcl，150mM NaCl，lmM EDTA，1mM EGTA，1％Nonidet P-40，0.2％SDS，10mM NaF，2mM Na_2VO_4)裂解。裂解后的細胞液與等量的SDS樣品緩沖液混合后保存，調(diào)整細胞濃度至2000個／μl。同時制備HeLa細胞作為對照。細胞裂解液使用前于-80℃保存。 (二)蛋白質(zhì)免疫印記雜交 裂解細胞液煮沸后經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC膜)后與血清孵育。同一份血清同時與HPAEC和HeLa反應(yīng)，每個電泳槽20μl裂解細胞液。NC膜用含5％脫脂奶粉的PBS封閉，于4℃過夜。用PBS-NP40(含有0.05％NP40的PBS)洗滌3次后，NC膜同患者血清(以PBS做1：100稀釋)于室溫反應(yīng)3h。PBS-NP40洗滌3次后，NC膜于羊抗人IgG(H+L)的PBS(1：7500，Promega，Corp．USA)中孵育2h。再次用PBS-NP40洗滌3次，NC膜上結(jié)合的IgG蛋白經(jīng)BCIP／NBT顯影觀察。以上所有的孵育反應(yīng)過程均在封閉的聚乙烯透明袋中進行。 三、抗-HPAEC特異性抗體洗脫印記雜交 為分析抗HPAEC抗體同其它自身抗體的結(jié)構(gòu)相關(guān)性，NC膜上同HPAEC抗原結(jié)合的自身抗體，用ImmunoPure IgG洗脫緩沖液(PIERCE，USA)洗脫。含有目的抗體的NC膜，置于3ml洗脫緩沖液中，震蕩5min后，收集洗脫液。另取3ml洗脫緩沖液，重復(fù)上述過程一次。于最后收集的6ml洗脫液中加入800μl 1M Tris-HCl(PH 7.5)，調(diào)整pH值至7.0。血清IgG抗體洗脫液，進一步同HPAEC和HeLa細胞抗原雜交反應(yīng)。 四、流式細胞分析術(shù)檢測細胞表面抗原 (一)細胞的收集 用0.01％EDTA／PBS(含鈣離子)10-20ml沖洗細胞培養(yǎng)瓶，適當用力拍打，使附壁生長的HPAEC從內(nèi)壁解離。重復(fù)兩次，收集所有細胞懸液，至計數(shù)后平均每個樣品細胞數(shù)2～4×10~4個。HeLa細胞則直接取出同樣數(shù)量細胞的細胞懸液。用2％FCS／PBS液洗滌兩次后，離心，各留取約2ml的細胞懸液。 (二)細胞樣品熒光抗體染色 每一個染色管中加入200μl的細胞懸液后，加入2μl血清�；靹蚝�4℃避光反應(yīng)1h。每管加入2％FCS／PBS溶液2ml，低溫離心(2000rpm，5min)，洗滌兩次，棄上清。待檢樣品用1μl anti-Human IgG-FITC標記染色，另設(shè)陰性對照管及陽性對照管，陰性對照不加熒光抗體，陽性對照加入anti-Human CD54 IgG-Biotin及Avidin-FITC各1μl，混勻后4℃避光反應(yīng)1h。用2％FCS／PBS洗滌兩次后，棄上清，靜置15min后，上機。 (三)流式細胞儀檢測 調(diào)定參數(shù)后，通過流式細胞儀，利用FACS CELLQUEST軟件獲取細胞，每個樣品分析15，000個細胞，以陰性對照為參考，對所檢測標本進行定性分析，陽性對照管所在區(qū)域設(shè)為陽性分析結(jié)果。 五、分離純化血清IgG抗體 患者血清IgG抗體應(yīng)用ImmunoPure IgG(PIERCE，USA)純化分析試劑盒分離純化。血清用結(jié)合緩沖液1：1稀釋后，10，000rpm離心20min。取上清加至蛋白AIgG親和分離柱中。樣品與蛋白A瓊脂糖凝膠充分作用后，用15ml結(jié)合緩沖液沖洗。結(jié)合的IgG用5ml洗脫緩沖液洗脫，洗脫液用500μl結(jié)合緩沖液中和。通過酶標儀280nm測定IgG濃度。 六、ELISA方法測定細胞培養(yǎng)上清RANTES濃度 分離出的IgG抗體加至HPAEC的培養(yǎng)液中，調(diào)整IgG的終濃度至1mg／dl。孵育48h后，收集培養(yǎng)上清。用ELISA(RD SYSTEMS，USA)試劑盒檢測上清中RANTES含量。通過酶標儀于540nm波長讀取OD值，用SoftMax Pro 4.3.1 LS軟件分析數(shù)據(jù)，繪制標準曲線，計算RANTES含量(pg／ml)。 實驗結(jié)果 一、RNA-IPP篩選血清 通過RNA-IPP分析法，選出抗U1RNP抗體陽性血清64例。其中SLE 31例，MCTD14例，SSc 3例，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)2例，干燥綜合征2例，PM、未分化CTD及皮膚型紅斑狼瘡患者各1例，另有9例患者的診斷尚不十分明確。64例中有4例合并PAH。 二、免疫雜交分析檢測抗HPAEC自身抗體 通過RNA-IPP篩選的64例抗U1RNP抗體陽性血清標本中，其中有37例含有一種針對HPAEC31kDa抗原(HPA31)的抗體。37例抗HPA31抗體陽性標本中有14例可同時檢測到與HPAEC 90kDa抗原(HPA90)反應(yīng)的自身抗體。兩種抗HPAEC抗體出現(xiàn)的陽性率分別為57.8％(37／64)和21.9％(14／64)�？笻PA31抗體在HeLa細胞抗原檢出陽性率僅為9.4％(6／64)，而在抗HPA31抗體陰性的血清和以HeLa細胞為抗原的反應(yīng)中，抗HPA90抗體均未檢出。提示HPA31和HPA90抗原主要在HPAEC上表達，抗U1RNP抗體陽性患者血清中存在特異性抗HPAEC的自身抗體�？笻PA31抗體和抗HPA90抗體，在4例合并PAH患者血清有3例出現(xiàn)陽性，2例抗U1RNP抗體陰性合并PAH者及健康志愿者血清中兩種抗體均陰性。 另外，與HeLa細胞抗原反應(yīng)時，37例抗HPA31抗體陽性的標本中有33例，同時檢測出抗32kDa及30kDa抗原的自身抗體(抗32／30kDa抗體)，出現(xiàn)的比率為89％。提示HeLa細胞的32／30kDa蛋白同HPAEC的31kDa蛋白、或者它們的抗體之間可能存在某種關(guān)聯(lián)。 三、抗HPA31抗體同抗U1、U2、SmRNP抗體及抗U1RNP-B’／B、A、70K抗體相關(guān)性分析 RNA-IPP分析發(fā)現(xiàn)，64份抗U1RNP抗體陽性血清，其中37例抗HPA31抗體陽性，而抗U1RNP抗體陰性血清則未檢出抗HPA31抗體�？筓1RNP抗HPA31抗體的檢出與抗U1RNP抗體存在顯著的相關(guān)性�？笻PA31抗體陽性血清中，抗U2RNP抗體及抗Sm抗體陽性者分別為11份和7份，僅占30％及19％。同抗HPA31抗體陰性組相比，均無顯著性差異。 免疫印跡雜交結(jié)果顯示，抗HPA90抗體僅見于抗HPA31抗體陽性血清標本，在抗HPA31抗體陰性標本中則未檢出，抗HPA90抗體與抗HPA31抗體具有顯著相關(guān)性(P＜0.001)�？笻PA31抗體陽性37例中有27例抗U1RNP-B’／B抗體陽性，占73％，而抗HPA31抗體陰性27例中僅有6例陽性，占22.2％(x~2=16.097，P＜0.005)�？笻PA31抗體的出現(xiàn)同抗U1RNP-B’／B抗體有相關(guān)性�？笻PA31抗體陽性的血清，抗U1RNP-A和抗U1RNP-70K的自身抗體的檢出率分別為67.6％(25／37)以及37.8％(14／37)，其中抗U1RNP-A抗體在抗HPA31抗體陽性組出現(xiàn)的比率明顯高十抗HPA31抗體陰性組(x~2=7.346，P＜0.01)。在抗-U1RNP抗體陰性及健康對照者的血清中，抗U1RNP-B’／B，A及70K抗體均陰性�？笻PA31抗體的檢出與抗U1RNP-B’／B抗體及抗U1RNP-A抗體有關(guān)聯(lián)。 四、抗HPAEC抗體洗脫印記分析 抗HPA31抗體和抗HPA90抗體洗脫液，分別同HPAEC及HeLa細胞抗原行免疫印記雜交分析。結(jié)果顯示，抗HPA31抗體不僅同HPA31抗原反應(yīng)，同時識別HPA90抗原。但抗HPA31抗體不能識別U1RNP-B’／B、A及70K抗原，也不能同HeLa細胞上的任何抗原(包括30kDa及32kDa抗原)反應(yīng)。表明抗HPA31抗體同抗U1RNP-B’／B、A和70K抗體以及同HeLa細胞30kDa及32kDa抗原的抗體無交叉反應(yīng)；抗HPA90抗體經(jīng)洗脫雜交反應(yīng)后發(fā)現(xiàn)，它可以和HPA31抗原以及HeLa細胞的50kDa，32kDa和30kDa抗原發(fā)生反應(yīng)。以上結(jié)果說明抗HPA90抗體與抗HPA31抗體之間有交叉反應(yīng)性，并且提示HPA90與HeLa細胞50kDa，32kDa和30kDa的抗原及相應(yīng)抗體之間存在關(guān)聯(lián)。 五、流式細胞分析檢測HPAEC表面抗原 6份抗HPAEC陽性血清中有4份可以檢測到與HPAEC表面抗原反應(yīng)的抗體，而所有抗HPAEC陰性的血清中均未檢出。HeLa細胞表面與血清抗體結(jié)合的表面抗原均為陰性。提示與HPAEC特異性抗體反應(yīng)的抗原存在于細胞的表面，且主要在HPAEC上表達。 六、抗HPA31抗體對HPAEC分泌RANTES的影響 抗HPA31抗體陽性血清純化分離的IgG抗體加入HPAEC的培養(yǎng)上清，共同孵育后，上清中RANTES的平均濃度為23.1pg／ml，而抗HPA31抗體陰性者，RANTES的平均濃度僅為13.1pg／ml。兩者間差異顯著(t=2.197，P＜0.05)。提示，抗HPA31抗體對HPAEC分泌RANTES有促進作用。 結(jié)論 1、CTD患者血清中存在與HPAEC反應(yīng)的特異性IgG抗體，該抗體可識別HPAEC分子量為31kDa(HPA31)和90kDa(HPA90)的抗原。 2、抗HPA31抗體的檢出同抗U1RNP抗體、抗U1RNP-B’／B抗體、抗U1RNP-A抗體有關(guān)聯(lián)，而與抗U1RNP-70K、抗U2RNP抗體、抗SmRNP抗體不相關(guān)。 3、抗HPA31抗體同抗HPA90抗體具有交叉反應(yīng)性，但兩者均不能識別U1RNP-B’／B、U1RNP-A及U1RNP-70K抗原�？笻PAEC抗體同抗U1RNP抗體結(jié)構(gòu)上無關(guān)聯(lián)。 4、HPA31抗原和HPA90抗原位于HPAEC的表面。 5、抗HPAEC抗體可通過與細胞表面的抗原結(jié)合，促進HPAEC分泌RANTES。 6、RANTES的產(chǎn)生和分泌增多可能是抗HPAEC抗體誘導(dǎo)肺血管內(nèi)皮損傷的機制之一。
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【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R392

【參考文獻】

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1 章友康，耿輝，趙明輝，鄒萬忠，鄂潔,鄭欣,王海燕;The significance of anti-endothelial cell antibodies in patients with lupus nephritis and immunoblloting analysis of the target components[J];Chinese Medical Journal;1999年07期

本文編號：2264388