【摘要】： 目的：在嚴(yán)重細(xì)菌感染性疾病的診斷中，降鈣素原以其潛在的應(yīng)用價(jià)值已成為應(yīng)用研究熱點(diǎn)。降鈣素原(procalcitonin，PCT)是無激素活性的降鈣素(calcitonin，CT)前肽物質(zhì)，為含116個(gè)氨基酸的糖蛋白，半衰期為20—24小時(shí)，在體內(nèi)穩(wěn)定性好。在正常及健康的個(gè)體中，PCT經(jīng)一系列的酶催化作用最后水解形成CT，故其血清PCT的濃度極低，僅為10—50pg／ml，一般的方法檢測不到。在系統(tǒng)炎癥反應(yīng)綜合癥(SIRS)、敗血癥、敗血癥休克等嚴(yán)重細(xì)菌感染患者的血清PCT顯著升高，其濃度可達(dá)正常水平的幾倍甚至上萬倍，并且PCT濃度和疾病嚴(yán)重程度成正相關(guān)，并隨著病情的發(fā)展變化而變化，因而PCT可作為診斷嚴(yán)重細(xì)菌感染、判斷病情與預(yù)后以及療效觀察的可靠指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)Genbank的人源PCT全序列修改了部分稀有密碼子，改變部分堿基序列但保持其氨基酸序列不變，采用多引物人工一步合成基因技術(shù)合成降鈣素原的全長基因，并將其構(gòu)建于原核表達(dá)載體pGEX-4T-1中，得到重組表達(dá)載體pGEX-4T-1／PCT，將pGEX-4T-1／PCT轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，得到融合蛋白經(jīng)純化后進(jìn)行動(dòng)物免疫，用改良了的方法進(jìn)行細(xì)胞融合后，采用細(xì)胞篩選方法以獲得可穩(wěn)定分泌鼠抗人PCT蛋白的雜交瘤細(xì)胞株，為日后制備抗PCT單克隆抗體，制備檢測PCT試劑盒，，及研究PCT的來源、生理病理功能等提供了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法：根據(jù)Genbank的人源PCT全序列修改了部分稀有密碼子，改變部分堿基序列但保持其氨基酸序列不變，使目的基因能更好地在大腸桿菌中高效表達(dá)。利用引物設(shè)計(jì)軟件，根據(jù)所設(shè)計(jì)的PCT的全長基因設(shè)計(jì)了18條引物，并在第一和第十八條引物分別引入BamHⅠ和XhoⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)，采用多引物人工一步合成基因技術(shù)將18條引物一次合成PCT的全長基因，以合成的全長基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR擴(kuò)增后構(gòu)建于pMD18-T載體中，將pMD18-T／PCT轉(zhuǎn)化TOP10后提取質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定并將菌液送測序。測序正確后將pMD18-T／PCT重組質(zhì)粒進(jìn)行BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切并割膠回收目的基因，再構(gòu)建于原核表達(dá)載體pGEX-4T-1中，得到重組表達(dá)載體pGEX-4T-1／PCT，將pGEX-4T-1／PCT轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，得到了融合蛋白，與所購買的抗PCT單克隆抗體進(jìn)行Western blot鑒定。融合蛋白經(jīng)谷胱甘肽—S—轉(zhuǎn)移酶親和層析柱純化，免疫Balb／c小鼠。用改良了的方法進(jìn)行細(xì)胞融合后，采用細(xì)胞篩選方法得到2株可穩(wěn)定分泌鼠抗人PCT蛋白的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為6A4、7D6。并將由雜交瘤細(xì)胞株所分泌的鼠抗人PCT蛋白與已純化的PCT蛋白進(jìn)行Western blot檢測其特異性。 結(jié)果：采用多引物人工一步合成基因技術(shù)合成PCT的全長基因，PCR擴(kuò)增后構(gòu)建于pMD18-T載體中，將pMD18-T／PCT轉(zhuǎn)化TOP10后提取質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，得到了大小與預(yù)期相符的目的條帶。將經(jīng)酶切鑒定正確的菌株送測序，將測定的基因序列與所設(shè)計(jì)的PCT序列用0miga分析軟件進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示有一株菌株目的基因序列與所設(shè)計(jì)的PCT序列100％相符，表明重組載體中插入的序列為PCT的全長基因，插入序列中無堿基突變。將測序正確的pMD18-T／PCT重組質(zhì)粒進(jìn)行BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切并割膠回收目的基因，再構(gòu)建于原核表達(dá)載體pGEX-4T-1中，得到重組表達(dá)載體pGEX-4T-1／PCT，將pGEX-4T-1／PCT轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，提取質(zhì)粒進(jìn)行BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，得到了大小與預(yù)期相符的目的條帶。通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，得到的融合蛋白經(jīng)15％SDS-PAGE電泳鑒定在相當(dāng)分子量為40 ku處有目的蛋白出現(xiàn)，與預(yù)期相符。將融合蛋白與所購買的抗PCT單克隆抗體進(jìn)行Western blot鑒定結(jié)果顯示融合蛋白與抗PCT單克隆抗體可發(fā)生特異性反應(yīng)。融合蛋白經(jīng)谷胱甘肽—S—轉(zhuǎn)移酶親和層析柱純化，得到了純度＞60％的GST-PCT蛋白。成功免疫Balb／c小鼠，得到血清效價(jià)1：20000的小鼠，采用經(jīng)改良的方法進(jìn)行細(xì)胞融合后，篩選得到2株可穩(wěn)定分泌鼠抗人PCT蛋白的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為6A4、7D6。經(jīng)Western blot鑒定由雜交瘤細(xì)胞株所分泌的鼠抗人PCT蛋白與己純化的PCT抗原可發(fā)生特異性反應(yīng)，與菌體蛋白不反應(yīng)，特異性較強(qiáng)。 結(jié)論：1．根據(jù)Genbank的人源PCT全序列修改了部分稀有密碼子但保持其氨基酸序列不變，使目的基因能在大腸桿菌中高效表達(dá)。2．改變傳統(tǒng)的直接從基因庫中提取目基因的方法，而改為采用多引物人工一步合成基因技術(shù)成功合成了PCT的全長基因，并得到了高效表達(dá)的GST-PCT蛋白，為制備抗PCT單克隆抗體奠定了基礎(chǔ)。3．應(yīng)用雜交瘤細(xì)胞篩選技術(shù)成功得到2株可穩(wěn)定分泌鼠抗人PCT蛋白的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為6A4、7D6，經(jīng)檢測具有高特異性和親和力，為嚴(yán)重細(xì)菌感染性疾病的診斷提供了重要手段，為深入研究PCT的來源、病理生理作用以及臨床應(yīng)用提供了重要工具。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2262954