【摘要】： 目的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)具有易于獲取,高度的自我更新能力,體外能大量擴(kuò)增,可跨胚層分化為三個(gè)胚層來(lái)源的細(xì)胞等特點(diǎn),因而被廣泛應(yīng)用于組織工程、再生醫(yī)學(xué)及臨床多種疾病的細(xì)胞移植治療。BMSCs在體外能被誘導(dǎo)分化為上皮細(xì)胞,將體外培養(yǎng)的BMSCs移植到堿燒傷的兔角膜表面后,發(fā)現(xiàn)BMSCs能向角膜基質(zhì)遷移并向角膜上皮細(xì)胞分化,表明體內(nèi)局部微環(huán)境也可誘導(dǎo)BMSCs分化成與微環(huán)境功能相適應(yīng)的細(xì)胞,但其機(jī)理尚不十分清楚。課題組已有實(shí)驗(yàn)表明胎兒腸壁結(jié)締組織能在體外誘導(dǎo)BMSCs分化為上皮細(xì)胞,本實(shí)驗(yàn)擬比較羊膜、胎兒腸系膜及腸粘膜下層的結(jié)締組織在體外誘導(dǎo)BMSCs分化為上皮細(xì)胞的作用差異,從而為進(jìn)一步研究局部微環(huán)境誘導(dǎo)BMSCs分化的機(jī)制及其在組織工程中的應(yīng)用,提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第一部分 1收集4~5個(gè)月引產(chǎn)胎兒的骨髓細(xì)胞,以全骨髓直接貼壁法和密度離心貼壁法分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增BMSCs,比較兩種方法獲取BMSCs的數(shù)量。流式細(xì)胞儀檢測(cè)P3 BMSCs的表型。結(jié)果顯示:全骨髓直接貼壁法分離擴(kuò)增出的細(xì)胞數(shù)多于密度離心貼壁法,P0.01;P3BMSCs為均一的長(zhǎng)梭形,呈典型的漩渦狀生長(zhǎng)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩種方法獲取的P3細(xì)胞均表達(dá)CD29和CD71,不表達(dá)CD34及HLA-DR,均一性達(dá)80.73±0.17%;兩組細(xì)胞表達(dá)表面抗原熒光強(qiáng)度的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05。 2實(shí)驗(yàn)觀察了不同濃度DAPI對(duì)P3 BMSCs的標(biāo)記,并比較了其與凍存復(fù)蘇P3 BMSCs的DAPI標(biāo)記率。結(jié)果見4種濃度DAPI標(biāo)記BMSCs 2h后的標(biāo)記率均為100%,雖然高濃度組的藍(lán)色熒光較低濃度組明亮,但均隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸減弱。統(tǒng)計(jì)顯示:40μg/ml組的陽(yáng)性率高于25、5μg/ml組,P0.01,且與50μg/ml組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;各組標(biāo)記濃度與時(shí)間的標(biāo)記率間有明顯的交互作用,即隨時(shí)間增加4種濃度的熒光標(biāo)記率均遞減。40μg/ml DAPI標(biāo)記凍存復(fù)蘇后的P3 BMSCs的標(biāo)記率與非凍存細(xì)胞相近。 3不同濃度的EGF、IGF-1體外誘導(dǎo)P3 BMSCs培養(yǎng)7d后,多數(shù)細(xì)胞為梭形,少數(shù)細(xì)胞呈寬大扁平的上皮樣細(xì)胞。誘導(dǎo)培養(yǎng)7d后細(xì)胞表達(dá)CK和EMA的陽(yáng)性細(xì)胞率統(tǒng)計(jì)顯示:①單用EGF 30 ng/ml或IGF-1 50 ng/ml誘導(dǎo)組的CK和EMA陽(yáng)性細(xì)胞率高于其余濃度組,P0.05;其中100 ng/mlEGF或IGF-1組僅少數(shù)細(xì)胞EMA陽(yáng)性,CK均為陰性。②EGF和IGF-1聯(lián)合誘導(dǎo)各組的CK和EMA陽(yáng)性細(xì)胞率均高于各單用EGF或IGF-1組,P0.01;30 ng/ml EGF和50 ng/ml IGF-1聯(lián)合組的CK陽(yáng)性細(xì)胞率高于其余聯(lián)合誘導(dǎo)組,P0.01;但聯(lián)合誘導(dǎo)各組間的EMA陽(yáng)性細(xì)胞率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。③空白對(duì)照組的CK和EMA均為陰性。 第二部分 1取15例羊膜和20例4~5個(gè)月引產(chǎn)胎兒的腸壁、腸系膜。用機(jī)械分離和酶消化的方法除去上皮,制成羊膜、腸系膜和腸粘膜下層的結(jié)締組織塊。光鏡觀察見制備的三種結(jié)締組織表面無(wú)上皮細(xì)胞。 2將50μl (4.0×106個(gè)/ml)DAPI標(biāo)記的P3 BMSCs分別種植于三種結(jié)締組織上誘導(dǎo)培養(yǎng),另設(shè)同時(shí)加EGF和IGF-1的對(duì)照組,以及細(xì)胞爬片對(duì)照組。液面下培養(yǎng)7d后,升至液-氣平面培養(yǎng)。各組誘導(dǎo)培養(yǎng)8～12d后,冰凍切片的三種結(jié)締組織表面均可見藍(lán)色熒光標(biāo)記的細(xì)胞;同一切片HE染色后,可見結(jié)締組織表面有與熒光標(biāo)記細(xì)胞分布一致的體積較大、核明顯的細(xì)胞。免疫組化染色見三種結(jié)締組織表面的部分細(xì)胞有CK及EMA表達(dá)。未培養(yǎng)的三種結(jié)締組織中均表達(dá)EGF;腸系膜及腸粘膜下層結(jié)締組織同時(shí)還表達(dá)IGF-1,但羊膜中IGF-1為陰性。 3各組誘導(dǎo)培養(yǎng)12d后的冰凍切片和鋪片經(jīng)免疫熒光染色后:①CLSM下見三種結(jié)締組織上均有胞核為藍(lán)色熒光標(biāo)記的細(xì)胞,部分藍(lán)色熒光標(biāo)記核的細(xì)胞質(zhì)中有CK的紅色熒光;僅羊膜上部分藍(lán)色熒光標(biāo)記核的細(xì)胞有微弱的EMA綠色熒光表達(dá)。②CLSM下隨機(jī)選取鋪片上5個(gè)非重疊視野,分別計(jì)數(shù)有紅藍(lán)雙色熒光標(biāo)記及單一藍(lán)色熒光標(biāo)記的細(xì)胞,計(jì)算出CK陽(yáng)性細(xì)胞率。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示:三種結(jié)締組織與生長(zhǎng)因子聯(lián)合誘導(dǎo)三個(gè)組的CK熒光陽(yáng)性細(xì)胞率均高于單用三種結(jié)締組織及單用生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的細(xì)胞爬片組,P0.05;三個(gè)聯(lián)合誘導(dǎo)組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05;單用羊膜誘導(dǎo)組CK熒光陽(yáng)性細(xì)胞率高于單用腸系膜及腸粘膜下層誘導(dǎo)組,P0.05。 4 SEM下見三種結(jié)締組織上生長(zhǎng)的BMSCs呈梭形,細(xì)胞表面有短而粗的微絨毛狀突起。TEM下見組織上種植的BMSCs的核較大,橢圓形,核質(zhì)比大,常染色質(zhì)多,核糖體、線粒體等豐富;BMSCs與結(jié)締組織間未見基膜形成。 全文結(jié)論 1全骨髓直接貼壁法分離擴(kuò)增獲取的BMSCs數(shù)多于密度離心貼壁法。 2 DAPI標(biāo)記BMSCs最佳終濃度是40ug/ml標(biāo)記2h。 3 EGF和IGF-1在體外均有誘導(dǎo)BMSCs向上皮細(xì)胞分化的作用;兩者有協(xié)同作用,以30 ng/mlEGF和50 ng/ml IGF-1聯(lián)合的協(xié)同作用最強(qiáng)。 4腸粘膜下層、腸系膜和羊膜的結(jié)締組織均能誘導(dǎo)BMSCs向上皮細(xì)胞分化,羊膜單獨(dú)誘導(dǎo)作用最強(qiáng);三種結(jié)締組織中均有EGF表達(dá),IGF-1僅表達(dá)于腸系膜及腸粘膜下層結(jié)締組織,提示結(jié)締組織中的生長(zhǎng)因子可能是其誘導(dǎo)BMSCs向上皮細(xì)胞分化的內(nèi)源性因素。 5外源性EGF和IGF-1有協(xié)同三種結(jié)締組織誘導(dǎo)BMSCs向上皮細(xì)胞分化的作用。 6電鏡下在BMSCs與結(jié)締組織之間未見基膜形成。
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【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2259874