【摘要】： 目的:神經(jīng)膠質(zhì)瘤(Gliolma)是神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤,它起源于神經(jīng)組織中的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,神經(jīng)膠質(zhì)瘤是一種癌細(xì)胞起源、病理結(jié)構(gòu)、生物學(xué)特征和臨床癥狀都很特殊的腫瘤,其惡性程度高且術(shù)后易復(fù)發(fā),目前采用的手術(shù)、化療、放療三大常規(guī)治療措施的效果均不理想,原因在于上述方法屬減數(shù)性治療,無法徹底清除殘留細(xì)胞。人們關(guān)注著開拓新的治療途徑,在免疫治療中,腫瘤單抗和腫瘤疫苗是當(dāng)今研究的熱點(diǎn),其核心是找到腫瘤的特異抗原或相關(guān)抗原,目前,雖然還未發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤特異抗原,但膠質(zhì)瘤相關(guān)抗原的存在已得到人們的確認(rèn),這類抗原為膠質(zhì)瘤細(xì)胞表面所特有。80年代早期開始,利用雜交瘤技術(shù),將人腦膠質(zhì)瘤培養(yǎng)細(xì)胞系LN-18和SHG-44作為抗原免疫小鼠,通過細(xì)胞融合,克隆化培養(yǎng)后獲得分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株�？鼓z質(zhì)瘤單克隆抗體被應(yīng)用于膠質(zhì)瘤實驗研究和診斷治療以及膠質(zhì)瘤細(xì)胞抗原的分析,因其效價高,特異性好的優(yōu)勢,在膠質(zhì)瘤的免疫生物學(xué)以及免疫治療方面取得了突破性的進(jìn)展。本實驗利用人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(SKN-SH)作為抗原免疫BALB/c小鼠,通過細(xì)胞融合、克隆化培養(yǎng),旨在建立新的雜交瘤細(xì)胞株,其分泌的單克隆抗體的生物學(xué)特性尚有待于研究,可能為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的診斷及治療提供新的制劑,并為基因工程抗體的研究奠定基礎(chǔ)。 方法: 1.抗原的制備 傳代培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞是較常用的一種抗原,其優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞單一,易于獲得,實驗方便及便于重復(fù)。本實驗采用SKN-SH細(xì)胞作為抗原,這種顆粒性的抗原具有較強(qiáng)的免疫原性,可以不加佐劑,直接免疫小鼠。 2.免疫方案 常用的免疫途徑包括皮下、靜脈、腹腔和肌肉注射。本實驗采用腹腔注射免疫,其是刺激脾的最佳方法。收集SKN-SH細(xì)胞6×107,離心洗滌,經(jīng)腹腔注射進(jìn)行初次免疫,間隔1周后,再取同量細(xì)胞追加免疫3次,每次間隔1周。末次加強(qiáng)免疫后3d取小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合為最佳時機(jī)。 3.小鼠骨髓瘤細(xì)胞系(SP2/0)細(xì)胞的準(zhǔn)備 為避免細(xì)胞出現(xiàn)返祖現(xiàn)象,應(yīng)用含8-AG的培養(yǎng)液進(jìn)行誘導(dǎo),增加對HAT的敏感性,有利于融合率的提高,使用濃度為20μg/ml,誘導(dǎo)1個月后,改用含10%胎牛血清的RPMI 1640(以下簡稱1640)培養(yǎng)液傳代培養(yǎng),選擇對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行融合。 4.細(xì)胞融合 取已免疫的小鼠脾臟,收集脾細(xì)胞,分別吸取1×10~8個脾細(xì)胞與4×10~7個SP2/0骨髓瘤細(xì)胞按2:1進(jìn)行融合,通過HAT選擇性培養(yǎng),使雜交瘤細(xì)胞增殖并形成克隆。 5.ELISA檢測 融合后10d,細(xì)胞克隆長大約占孔底面積的1/3～1/2,每個孔內(nèi)含1個或幾個克隆。此時應(yīng)在末次換液后2d內(nèi)及時對細(xì)胞克隆的培養(yǎng)上清做ELISA檢測。首先裂解SKN-SH細(xì)胞提取蛋白質(zhì)做陽性抗原包被96孔板,SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清做陰性對照包被96孔板,雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清作為一抗進(jìn)行ELISA檢測,然后篩選出分泌特異性單克隆抗體的陽性孔。 6.克隆化培養(yǎng) 由于融合初期形成的雜交瘤細(xì)胞不穩(wěn)定,染色體易丟失,因此細(xì)胞克隆一經(jīng)檢測為分泌抗體的陽性克隆,就應(yīng)及時進(jìn)行克隆化培養(yǎng)。本實驗采用有限稀釋法克隆化培養(yǎng),該法操作簡便,不需特殊設(shè)備,是最常用的方法。其原理是將細(xì)胞懸液進(jìn)行系列稀釋,為確保出現(xiàn)單個克隆,每次克隆應(yīng)稀釋為3種細(xì)胞濃度,即5個/ml、10個/ml、30個/ml,然后每孔加100μl,理論上計算每個孔分別含0.5個、1個和3個細(xì)胞,一般總能得到單克隆孔。經(jīng)過3次的克隆化培養(yǎng),直至細(xì)胞克隆分泌抗體的陽性率達(dá)100%,將雜交瘤細(xì)胞予以凍存。 7.腹水的收集 將雜交瘤細(xì)胞大量傳代培養(yǎng)后,收集細(xì)胞并接種于經(jīng)降脂烷預(yù)處理的BALB/c小鼠腹腔,14d后收集含單抗的腹水。 8.復(fù)蘇雜交瘤細(xì)胞由于雜交瘤細(xì)胞不宜在體外長期培養(yǎng),防止變異丟失,凍存的細(xì)胞應(yīng)每隔1～2年復(fù)蘇出來,檢測抗體分泌情況,必要時再進(jìn)行克隆化培養(yǎng)。 結(jié)果: 1.經(jīng)HAT選擇性培養(yǎng)后,74孔出現(xiàn)由數(shù)個細(xì)胞組成的集落,即細(xì)胞克隆; 2.對形成細(xì)胞克隆的孔進(jìn)行ELISA檢測,篩選出24個分泌特異性抗體的陽性孔; 3.從抗體分泌陽性的孔中篩選出3個強(qiáng)陽性孔進(jìn)行克隆化培養(yǎng),3次克隆培養(yǎng)后,分泌抗體陽性率達(dá)100%; 4.雜交瘤細(xì)胞經(jīng)小鼠腹腔注射后,獲得含大量單抗的腹水10ml。結(jié)論:本研究通過雜交瘤細(xì)胞融合技術(shù),成功地制備了1株分泌特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,可能為腦膠質(zhì)瘤的診斷和治療提供了新的制劑,同時為基因工程抗體的研究奠定基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R739.4;R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2254042