【摘要】： 目的構(gòu)建含抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單鏈抗體(TfR-scFv)和EGFP融合蛋白基因的重組真核表達(dá)載體pTfRscfv-EGFP。并轉(zhuǎn)染至COS-7細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá),鑒定融合蛋白的生物學(xué)活性。為單鏈抗體-熒光融合蛋白在腫瘤示蹤、定位、顯像等方面的研究奠定基礎(chǔ)。 方法以Chi7579-pγ-Expr和Chi7579-pκ-Expr載體為模板,設(shè)計(jì)兩對(duì)引物引入中間連接肽(Gly4Ser)3以及酶切位點(diǎn)HindⅢ和BamHⅠ,采用重疊延伸PCR的方法,分別擴(kuò)增抗TfR單鏈抗體的輕、重鏈可變區(qū)(VL、VH)基因,二基因之間以連接肽(Gly4Ser)3的編碼序列連接,從而構(gòu)建具有前導(dǎo)肽的L-VH-Linker-VL單鏈抗體基因。將獲得的單鏈抗體基因克隆至pGEM-T載體(scFv-T),轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,進(jìn)行藍(lán)白篩選,挑取陽(yáng)性克隆擴(kuò)增。提取質(zhì)粒以HindⅢ和BamHⅠ雙酶切鑒定,并測(cè)序證實(shí)正確后,亞克隆至pEGFP-N1,獲得pTfRscfv-EGFP,轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞,倒置相差熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達(dá),熒光分光光度計(jì)檢測(cè)細(xì)胞分泌上清熒光強(qiáng)度,并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)細(xì)胞分泌上清與乳腺癌細(xì)胞MCF-7及黑色素瘤細(xì)胞A375的結(jié)合活性。 結(jié)果測(cè)序結(jié)果表明獲得了正確的L-VH-Linker-VL單鏈抗體基因序列;亞克隆至pEGFP-N1后,HindⅢ和BamHⅠ雙酶切可見(jiàn)約800bp的小片段和約4.5Kb的大片段,與理論計(jì)算值相符,表明pTfRscfv-EGFP真核表達(dá)載體構(gòu)建成功;表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞,24小時(shí)后,可見(jiàn)熒光在細(xì)胞中呈指環(huán)狀分布,細(xì)胞核無(wú)表達(dá),為典型的分泌性表達(dá)模式,而pEGFP-N1空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞中,熒光則呈彌漫性分布,以核中分布較多。收集轉(zhuǎn)染后72h的細(xì)胞培養(yǎng)上清,用F4500熒光分光光度計(jì)檢測(cè)其熒光強(qiáng)度,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞上清的熒光強(qiáng)度較對(duì)照組高出約兩倍以上,證實(shí)抗TfR-scFv-EGFP融合蛋白在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中分泌性表達(dá);FCM檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清與A375細(xì)胞及MCF-7細(xì)胞的結(jié)合,結(jié)果表明抗TfR-scFv-EGFP融合蛋白能夠與上述天然高表達(dá)TfR的細(xì)胞特異性的結(jié)合,對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)上清則未見(jiàn)與上述細(xì)胞有結(jié)合。 結(jié)論成功構(gòu)建抗TfR-scFv-EGFP融合蛋白的真核表達(dá)載體pTfRscfv-EGFP,融合蛋白可在COS-7細(xì)胞中分泌性表達(dá),且具有與TfR陽(yáng)性細(xì)胞結(jié)合的活性并發(fā)綠色熒光,本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步將該融合蛋白作為腫瘤示蹤、定位、顯像的特異性分子奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective To construct a recombinant eukaryotic expression vector pTfRscfv-EGFP containing anti-transferrin receptor single-chain antibody (TfR-scFv) and EGFP fusion protein gene and transfect it into COS-7 cells to identify the biological activity of the fusion protein.
Methods Using Chi7579-pgamma-Expr and Chi7579-pkappa-Expr vectors as templates, two pairs of primers were designed to introduce intermediate ligand 3 (Gly4Ser) and the digested sites Hind III and BamH I. The light and heavy chain variable region (VL, VH) genes of anti-TfR single chain antibodies were amplified by overlapping extension PCR, and the two genes were linked by the coding sequence of the ligand peptide (Gly4Ser) 3. Then, the L-VH-Linker-VL single chain antibody gene with a propeptide was constructed. The obtained single chain antibody gene was cloned into pGEM-T vector (scFv-T), transformed into E.coli DH5a, screened with blue and white, and amplified with positive clones. Scfv-EGFP was transfected into COS-7 cells. The expression of green fluorescent protein was observed under inverted phase contrast fluorescence microscope. The fluorescence intensity of supernatant secreted by cells was measured by fluorescence spectrophotometer. The binding activity of supernatant secreted by cells to MCF-7 cells and A375 cells was detected by flow cytometry (FCM).
Results Sequencing results showed that the correct sequence of L-VH-Linker-VL single chain antibody gene was obtained. After subcloning to pEGFP-N1, a small fragment of about 800 BP and a large fragment of about 4.5 Kb could be seen in Hind III and BamH I digestion, which were in agreement with the theoretical value. The results showed that the eukaryotic expression vector of pTfRscfv-EGFP was successfully constructed. After transfection, the fluorescence showed a circular distribution in the cell nucleus and no expression in the cell nucleus, which was a typical secretory expression pattern. In pEGFP-N1 empty vector transfected cells, the fluorescence was diffusely distributed and distributed more in the nucleus. The fluorescence intensity of antiTfR-scFv-EGFP fusion protein was more than twice as high as that of the control group, which confirmed the secretory expression of antiTfR-scFv-EGFP fusion protein in the transfected cells. The binding of the supernatant of the transfected cells to A375 cells and MCF-7 cells was detected by FCM. The results showed that the antiTfR-scFv-EGFP fusion protein could specifically bind to the above natural TfR-expressing cells. Cell culture supernatant did not bind to the above cells.
Conclusion The eukaryotic expression vector pTfRscfv-EGFP against TfR-scFv-EGFP fusion protein has been successfully constructed. The fusion protein can be secreted in COS-7 cells, and has the activity of binding to TfR-positive cells with green fluorescence. This study laid a foundation for further using the fusion protein as a specific molecule for tumor tracing, localization and imaging.
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R392;R73-3

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本文編號(hào)：2248029