【摘要】：背景 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染呈世界性流行，急慢性肝炎中的特征性病理改變，如肝小葉內(nèi)的點(diǎn)狀壞死和匯管區(qū)邊緣的嗜酸性壞死的實(shí)質(zhì)均為凋亡，表明肝細(xì)胞凋亡是病毒性肝炎的重要病理現(xiàn)象，與肝組織炎癥的發(fā)生有密切聯(lián)系。 一貫認(rèn)為凋亡是細(xì)胞主動(dòng)的死亡過程，不引起炎癥反應(yīng)，但這與臨床現(xiàn)象并不符合�？赡苤挥性诘蛲黾�(xì)胞迅速被吞噬而無毒性物質(zhì)漏出時(shí)，才不引發(fā)炎癥反應(yīng)。如凋亡細(xì)胞數(shù)過多或吞噬細(xì)胞識別、吞噬能力存在障礙，細(xì)胞內(nèi)容物釋放，將導(dǎo)致炎癥反應(yīng)及組織損傷，這可能是某些疾病的重要發(fā)病機(jī)制。 病毒感染與宿主細(xì)胞凋亡之間可能有多方面的關(guān)系，HBV蛋白可能是調(diào)控肝細(xì)胞凋亡的一個(gè)必要因子。因HBV的X蛋白有多種活性，能調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑，故一些學(xué)者首先研究其對肝細(xì)胞凋亡的作用。但不同學(xué)者的研究結(jié)果不同：X蛋白與P53結(jié)合抑制凋亡、而促使細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化；最近的研究還表明X蛋白抑制Caspase 3的活性、或通過上調(diào)SAPK／JNK信號抑制Fas介導(dǎo)的凋亡；但與腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha，TNFα)結(jié)合則提高凋亡的敏感性，或通過其反式激活強(qiáng)化凋亡。提示同一病毒蛋白在肝細(xì)胞的不同情況可起完全相反的作用，也促使我們思索HBV是否還有某一成份能較穩(wěn)定抑制肝細(xì)胞凋亡。 HBV有2個(gè)核殼的開放讀框，其一指導(dǎo)合成21kDa的P21蛋白(hepatitis Bvirus c agent, HBcAg)，是病毒核殼的結(jié)構(gòu)成份；另一產(chǎn)生25kDa的前C／C蛋白，(終產(chǎn)物hepatitis B virus e agent, HBeAg)是免疫的調(diào)節(jié)因子，與乙型肝炎的發(fā)病機(jī)制關(guān)系最為密切。其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上截去信號肽后成為P22~e。P22~e的大部分進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，水解除去羧基端的肽段形成17kDa的HBeAg后才能向細(xì)胞外分泌。小部分P22~e仍滯留于肝細(xì)胞漿內(nèi)，長期以來對滯留的P22~e在感染中的作用不明。 在對HBV前C／nt 1896終止密碼子變異的研究中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的P22~e能與HBcAg形成雜合的核殼結(jié)構(gòu)而抑制病毒顆粒的包裝過程，故前C／C蛋白的缺失可導(dǎo)致病毒高復(fù)制。但我國的慢性HBV感染在血清HBe轉(zhuǎn)換時(shí)出現(xiàn)的前C變異，常伴隨病毒復(fù)制序列水平降低，這與其具有高復(fù)制能力似相矛盾。對此可能的解釋是前C變異株誘導(dǎo)感染肝細(xì)胞凋亡促使病毒清除，與HBeAg抑制免疫而增強(qiáng)病毒復(fù)制符合，從而提出：P22~e蛋白是否有抑制肝細(xì)胞凋亡的作用?本實(shí)驗(yàn)室劉定燮博士在博士研究中，曾經(jīng)闡明了表達(dá)P22~e蛋白的HepG2細(xì)胞有抑制甲氨喋呤，環(huán)孢素A等誘導(dǎo)凋亡的作用，但是對于抑制凋亡的分子途徑仍未進(jìn)一研究。 我們發(fā)現(xiàn)P22~e的后一段序列(AA23-73)與Fas(接收凋亡信號的細(xì)胞表面分子)死亡區(qū)結(jié)合蛋白(FADD)的死亡效應(yīng)區(qū)(DED)有23.5％的同源性。肝細(xì)胞通過FADD對TNFα敏感而誘導(dǎo)凋亡，已知有與DED氨基酸同源序列的Ⅱ型單純皰疹病毒E8蛋白和傳染性軟疣病毒MC159蛋白，能抑制Fas抗體(一種促效抗體，agonist antibody)和TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，HBV的P22~e蛋白可能也有相同的作用，但迄今尚無研究報(bào)告。滯留的P22~e通過TNF-TNFL、Fas-FasL中哪一條途徑抑制細(xì)胞凋亡，目前仍未見相關(guān)研究論文發(fā)表。 Tai等發(fā)現(xiàn)丙肝病毒(hepatitis C virus, HCV)感染的肝臟和HCV核心轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中都有核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factorκB, NF-κB)的激活，HCV感染的肝臟較正常者更易見到NF-κB的核染色，HCV核心轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中NF-κB激活產(chǎn)生對TNF誘導(dǎo)凋亡的抵抗，用四氫吡咯二硫代氨基甲酸鹽(PDTC)抑制NF-κB活化能使敏感性恢復(fù)，這些結(jié)果提示HCV感染可能通過激活NF-κB抑制凋亡，且HCV能逃避宿主的免疫監(jiān)視使得病毒持續(xù)存在，從而可能形成肝癌。也有報(bào)道HBV的X蛋白可激活NF-κB或經(jīng)NF-κB抑止HepG2凋亡。一貫認(rèn)為NF-κB在肝胚胎瘤發(fā)展以及肝細(xì)胞再生時(shí)，是一個(gè)基本的、必需的“生存因子”；而且NF-κB還被證實(shí)是細(xì)胞在各種外界刺激作用下起主要調(diào)節(jié)作用。一些病毒誘導(dǎo)的宿主細(xì)胞凋亡反應(yīng)與NF-κB激活有關(guān)，病毒感染后激活的NF-κB可能是激活天然免疫從而產(chǎn)生抗病毒活性的快速途徑。NF-κB在肝臟病變中的作用究竟是通過TNF-TNFL還是Fas-FasL途徑，目前仍未見相關(guān)研究。 NF-κB在成熟B細(xì)胞和漿細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的這種蛋白能與免疫球蛋白κ輕鏈內(nèi)含增強(qiáng)子的特異性序列結(jié)合，該序列由10個(gè)核苷酸組成(5-GGGACTTTCC-3)，命名為NF-κB。NF-κB廣泛存在于真核生物中，是一個(gè)由復(fù)雜的多肽亞單位組成的蛋白家族。它作為信號傳導(dǎo)途徑中的樞紐與機(jī)體免疫，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)以及胚胎發(fā)育等重要事件有著密切聯(lián)系，是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子。目前，對NF-κB的研究已成為一個(gè)非常引人關(guān)注的領(lǐng)域。 關(guān)于細(xì)胞凋亡，目前國內(nèi)外均側(cè)重于對凋亡信號在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的研究。通過激活或是抑制細(xì)胞內(nèi)某一蛋白的表達(dá)，研究其在細(xì)胞凋亡某一途徑中的作用，豐富和完善細(xì)胞凋亡的通路，更清楚地闡明肝病的發(fā)病機(jī)制。從分子水平闡明凋亡發(fā)生的機(jī)理，將是凋亡研究的方向以及熱點(diǎn)。此項(xiàng)課題將研究在以TNFα為刺激信號的細(xì)胞凋亡過程中，HBVP22~e，NF-κB在此過程中的相互作用，進(jìn)一步闡明HBV感染與免疫的某些基本問題。為此，本課題得到了國家自然科學(xué)基金支持。 目的 克隆乙型肝炎病毒P22~e基因，構(gòu)建其真核表達(dá)載體pEGFP-C2HBVP22~e，以人肝細(xì)胞癌HepG2細(xì)胞系為研究模型，探討在肝細(xì)胞凋亡過程中，，HBVP22~e基因是否通過NF-κB的信號途徑來抑制肝細(xì)胞凋亡的發(fā)生。 方法 1．以含1.2 copies HBV基因(adr亞型)p3.8Ⅱ質(zhì)粒為模板，以PrimerCl：1873-1891 5'GGA ATTCATGTCCAAGCTGTGCCTTGGGT3'(插入EcoR I酶切位點(diǎn))，PrimerC2：2454-2434 5’GCGGATCCCTAACATTGAGATTCCCGA 3’(插入BamH I酶切位點(diǎn))為一對引物按常規(guī)方法進(jìn)行PCR，獲得HBVP22~e基因cDNA。 2．利用通用T載體pMD18-T，將PCR獲得的HBVP22~e基因cDNA進(jìn)行克隆，獲得克隆載體pMD18-THBVP22~e，進(jìn)行EcoR I，BamH I雙酶切鑒定及克隆測序，以保證獲得HBVP22~e基因序列準(zhǔn)確無誤。 3．將pMD18-THBVP22~e EcoR I，BamH I雙酶切獲得HBVP22~e cDNA回收純化，利用pEGFP-C2質(zhì)粒，構(gòu)建HBVP22~e真核表達(dá)載體pEGFP-C2HBVP22~e。進(jìn)行EcoR I，BamH I雙酶切鑒定及測序，以保證以后表達(dá)HBVP22~e基因序列準(zhǔn)確無誤。 4．脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染pEGFP-C2HBVP22~e真核表達(dá)載體到HepG2細(xì)胞株中，經(jīng)G418及有限稀釋法篩選，獲得含HBVP22~e基因的人肝細(xì)胞癌HepG2細(xì)胞株，并用免疫組化鑒定EGFP-HBVP22~e融合蛋白細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)；微粒子免疫檢測培養(yǎng)上清中分泌的EGFP-HBVP22~e融合蛋白；熒光顯微鏡觀察和Western Blot檢測驗(yàn)證所獲得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系能夠穩(wěn)定表達(dá)EGFP-HBVP22~e融合蛋白；Western Blot及細(xì)胞免疫組化使用抗HBe抗體驗(yàn)證融合了EGFP的HBP22~e蛋白的免疫原性。 5．已終濃度333nM Act-D及100μg／L TNFα誘導(dǎo)刺激HepG2EGFP-HBVP22~e細(xì)胞凋亡，同時(shí)以HepG2細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對照，刺激時(shí)間8h、16h、24h、32h、40h、48h，使用流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry, FCM)，利用碘化丙啶(Propidium iodide, PI)染色，檢測具有亞G1劃DNA含量的細(xì)胞比例，代表凋亡細(xì)胞數(shù)；使用激光共聚焦顯微鏡(Laser Scanning Confocal Microscopy)，觀察Hoechst染色凋亡細(xì)胞核形態(tài)的變化。 6．由TNFα誘導(dǎo)的HepG2EGFP-C2HBVP22~e細(xì)胞系的凋亡過程中，采用激光共聚交顯微鏡、經(jīng)典的核蛋白電泳遷移率(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)技術(shù)及采用NF-κB抑制劑Calpain InhibitorⅠ(ALLN)抑制其信號通路，檢測觀察NF-κB的核轉(zhuǎn)移、活化等，以期探尋在HBVP22~e抑制肝細(xì)胞凋亡過程中，NF-κB信號途徑的重要意義。 結(jié)果 1．經(jīng)EcoR I，BamH I雙酶切鑒定及克隆測序，證明獲得HBVP22~e基因序列準(zhǔn)確無誤，獲得HBVP22~e基因克隆載體pMD18-THBVP22~e。 2．經(jīng)EcoR I，BamH I雙酶切鑒定及克隆測序，證明獲得含HBVP22~e及增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因真核表達(dá)載體pEGFP-C2HBVP22~e。 3．利用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，用G418選擇培養(yǎng)、有限稀釋法篩選，熒光顯微鏡觀察和Western Blot檢測結(jié)果表明，所獲得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系能夠穩(wěn)定表達(dá)EGFPHBVP22e融合蛋白。Western Blot及細(xì)胞免疫組化的陽性結(jié)果說明使用抗HBe抗體可以結(jié)合融合了EGFP的HBP22~e，融合蛋白中HBP22~e的抗原性沒有發(fā)生改變。熒光顯微鏡觀察和組化結(jié)果還可以看到HepG2中EGFPHBVP22~e的表達(dá)定位于胞漿與胞核，微粒子免疫熒光檢測培養(yǎng)上清證實(shí)轉(zhuǎn)染分泌蛋白含有HBeAg抗原性的物質(zhì)。 4．流式細(xì)胞術(shù)PI染色法檢測以Act-D，TNFα誘導(dǎo)HepG2，HeoG2EGFP-C2HBVP22~e細(xì)胞系發(fā)生凋亡結(jié)果顯示Oh，8h，16h兩細(xì)胞系凋亡率凋亡比較，P＞0.05，差別不顯著；而在24h，32h，40h，48h時(shí)，兩細(xì)胞系凋亡率比較，P＜0.01，差別顯著，HepG2EGFP-C2HBVP22~e細(xì)胞系凋亡率低于HepG2細(xì)胞系。激光共聚交顯微鏡觀察兩細(xì)胞系24h凋亡率比較，P＜0.01，差別顯著。二者結(jié)果基本相符。 5．激光共聚焦觀察以Act-D，TNFα誘導(dǎo)HepG2，HepG2EGFP-C2HBVP22e細(xì)胞系發(fā)生凋亡前后NF-κB的核內(nèi)外表達(dá)狀況，結(jié)果顯示HepG2EGFP-C2HBVP22~e誘導(dǎo)凋亡前、后，及誘導(dǎo)凋亡后的HepG2與未誘導(dǎo)凋亡的HepG2的NF-κB p65的核漿比例有顯著性差異(χ~2=109.072，v=3，P=0.000，組間差異有顯著性意義)；HepG2和HepG2EGFP-C2HBVP22~e凋亡后NF-κB p65的核漿比例有顯著性差異(χ~2=44.298，v=1，P=0.000，2組間差異有顯著性意義)，說明HepG2EGFP-C2HBVP22e細(xì)胞系發(fā)生凋亡前后NF-κB有明顯的核遷移現(xiàn)象。 6．HepG2，HepG2EGFP-C2HBVP22~e細(xì)胞系經(jīng)ALLN處理后，流式細(xì)胞術(shù)檢測以Act-D，TNFα誘導(dǎo)的凋亡率發(fā)生的變化，結(jié)果顯示ALLN處理與否HepG2凋亡率相差不顯著(t=0.544，P=0.615，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。而ALLN處理HepG2EGFPC-2HBVP22~e后凋亡率顯著高于未經(jīng)ALLN處理的HepG2EGFPC-2HBVP22~e(t=7.515，P=0.002，差異有顯著性意義)。說明ALLN抑制NF-κB，從而解除HBVP22~e對有凋亡的抑制作用。 7．以Act-D，TNFα誘導(dǎo)HepG2，HepG2EGFP-C2HBVP22e細(xì)胞系發(fā)生凋亡后，EMSA分析NF-κB核轉(zhuǎn)移狀況顯示HepG2凋亡前后NF-κB核遷移無差異(t=0.027，P=0.980，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。而HepG2 EGFP-C2HBVP22~e凋亡前后NF-κB有明顯的向核內(nèi)遷移現(xiàn)象(t=9.431，P=0.001，差異有顯著性意義)。 結(jié)論 1．實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HepG2EGFP-C2HBVP22~e細(xì)胞系在發(fā)生凋亡的時(shí)間上比HepG2細(xì)胞系有明顯延遲，及凋亡的發(fā)生率也明顯低于HepG2細(xì)胞系，自此可證明HepG2EGFP-C2HBVP22~e細(xì)胞系中，由于外源性基因HBVP22~e的引入及表達(dá)，對細(xì)胞的凋亡有明顯的抑制作用。 2．激光共聚焦顯微鏡及EMSA觀察以Act-D，TNFα誘導(dǎo)HepG2，HepG2EGFP-C2HBVP22~e細(xì)胞系發(fā)生凋亡前后NF-κB的核內(nèi)外表達(dá)狀況表明，HepG2EGFP-C2HBVP22~e細(xì)胞系發(fā)生凋亡前后，有明顯的NF-κB向核內(nèi)遷移現(xiàn)象。 3．NF-κB抑制劑ALLN的使用，可以使以Act-D，TNFα誘導(dǎo)HepG2EGFP-C2HBVP22~e細(xì)胞系凋亡發(fā)生率升高。 4．由上述結(jié)果可以初步推論出在HBVP22~e抑制肝細(xì)胞凋亡過程中，NF-κB信號途徑有著重要意義。
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【學(xué)位授予單位】：第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R373.21

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2241257