【摘要】：超抗原(supperantigen SAg)的概念由White 等于1989 年首先提出,它是由一組細菌或病毒編碼的蛋白分子可不需要抗原提呈細胞(APC)處理,以完整的蛋白質分子形式直接與APC 膜上的MHCⅡ類分子抗原結合槽外側結合,導致帶有特異性Vβ節(jié)段T 細胞大量活化增殖,其活化的T 細胞數是普通抗原數千倍乃至數萬倍。由于它產生的殺傷性很強的細胞毒T 細胞(CTL)對腫瘤極其強大的殺傷作用,因此,超抗原作為強大的T 細胞激活劑,有可能成為新一代抗腫瘤免疫分子,給腫瘤的治療帶來新的突破。近年來,超抗原理論得到迅猛發(fā)展,已成為腫瘤免疫治療新的熱點。葡萄球菌腸毒素A(staphylococcal enterotoxin A SEA)是金黃色葡萄球菌的產物,是近年來研究較多的一種細菌性超抗原。但是,SEA 激活的T 細胞所介導的細胞毒作用在對腫瘤細胞進行殺傷的同時對正常細胞也具有毒性,并且只能對MHCII+的腫瘤分子進行殺傷。因此,利用基因工程抗體對超抗原進行靶向,減少其副作用具有良好的應用前景,成為利用超抗原進行腫瘤免疫治療的新的研究熱點。 為了提高單鏈抗體的穩(wěn)定性,改善導向效果,本研究在B3 單鏈抗體(來源于一種腫瘤相關抗原對應的單抗)中引入了一對鏈間二硫鍵構建了二硫鍵穩(wěn)定單鏈抗體B3ds-scFv,通過重疊PCR 連接B3 抗體的VH 和VL 片段,并將PCR 產物克隆至pET22b表達載體(B3ds-scFv-pET22b);將測序正確的SEA 基因片段經酶切連接亞克隆至B3ds-scFv-pET22b 表達載體,重組表達載體經酶切鑒定兩片段連接正確;轉化BL21(DE3)后經IPTG 誘導表達,將表達的包涵體進行變性、復性,并用陽離子柱SP-Sepharose 將復性產物進行了初步純化,ELISA 測定此融合蛋白中抗體部分的結合活性以及其在37℃的穩(wěn)定性,并采用MTS 法檢測其對B3 抗原表面陽性細胞HT-29 的殺傷作用。經鑒定,重疊PCR 擴增得到了B3ds-scFv 抗體基因,并通過酶切連接成功融合了B3ds-scFv 和SEA(D227A)兩段基因,成功構建了B3ds-scFv-SEA(D227A)-pET表達載體,誘導表達產物以包涵體形式存在,占總蛋白量的33%左右;復性后的B3ds-scFv-SEA(D227A)保持了良好的抗原結合活性,并可成功殺傷人結腸癌細胞;在37℃及不同的溫度下孵育一定時間后,經ELISA 測定,37℃孵育一周蛋白仍能保持活性基本不變。本研究首次成功構建了B3ds-scFv-SEA(D227A)重組毒素,此蛋白具備了導向和殺傷腫瘤細胞的雙重功能,并且通過鏈間二硫鍵的引入大大提高了整個融合蛋白的穩(wěn)定性,為其發(fā)展為有效的腫瘤免疫治療靶向藥物奠定了基礎。
[Abstract]:The concept of superantigen (supperantigen SAg) was first proposed by White in 1989, when a group of proteins encoded by bacteria or viruses could not be treated with antigen-presenting cell (APC). In the form of complete protein molecules, MHC class 鈪，

本文編號：2217922