【摘要】：超抗原(supperantigen SAg)的概念由White 等于1989 年首先提出,它是由一組細菌或病毒編碼的蛋白分子可不需要抗原提呈細胞(APC)處理,以完整的蛋白質(zhì)分子形式直接與APC 膜上的MHCⅡ類分子抗原結(jié)合槽外側(cè)結(jié)合,導(dǎo)致帶有特異性Vβ節(jié)段T 細胞大量活化增殖,其活化的T 細胞數(shù)是普通抗原數(shù)千倍乃至數(shù)萬倍。由于它產(chǎn)生的殺傷性很強的細胞毒T 細胞(CTL)對腫瘤極其強大的殺傷作用,因此,超抗原作為強大的T 細胞激活劑,有可能成為新一代抗腫瘤免疫分子,給腫瘤的治療帶來新的突破。近年來,超抗原理論得到迅猛發(fā)展,已成為腫瘤免疫治療新的熱點。葡萄球菌腸毒素A(staphylococcal enterotoxin A SEA)是金黃色葡萄球菌的產(chǎn)物,是近年來研究較多的一種細菌性超抗原。但是,SEA 激活的T 細胞所介導(dǎo)的細胞毒作用在對腫瘤細胞進行殺傷的同時對正常細胞也具有毒性,并且只能對MHCII+的腫瘤分子進行殺傷。因此,利用基因工程抗體對超抗原進行靶向,減少其副作用具有良好的應(yīng)用前景,成為利用超抗原進行腫瘤免疫治療的新的研究熱點。 為了提高單鏈抗體的穩(wěn)定性,改善導(dǎo)向效果,本研究在B3 單鏈抗體(來源于一種腫瘤相關(guān)抗原對應(yīng)的單抗)中引入了一對鏈間二硫鍵構(gòu)建了二硫鍵穩(wěn)定單鏈抗體B3ds-scFv,通過重疊PCR 連接B3 抗體的VH 和VL 片段,并將PCR 產(chǎn)物克隆至pET22b表達載體(B3ds-scFv-pET22b);將測序正確的SEA 基因片段經(jīng)酶切連接亞克隆至B3ds-scFv-pET22b 表達載體,重組表達載體經(jīng)酶切鑒定兩片段連接正確;轉(zhuǎn)化BL21(DE3)后經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)表達,將表達的包涵體進行變性、復(fù)性,并用陽離子柱SP-Sepharose 將復(fù)性產(chǎn)物進行了初步純化,ELISA 測定此融合蛋白中抗體部分的結(jié)合活性以及其在37℃的穩(wěn)定性,并采用MTS 法檢測其對B3 抗原表面陽性細胞HT-29 的殺傷作用。經(jīng)鑒定,重疊PCR 擴增得到了B3ds-scFv 抗體基因,并通過酶切連接成功融合了B3ds-scFv 和SEA(D227A)兩段基因,成功構(gòu)建了B3ds-scFv-SEA(D227A)-pET表達載體,誘導(dǎo)表達產(chǎn)物以包涵體形式存在,占總蛋白量的33%左右;復(fù)性后的B3ds-scFv-SEA(D227A)保持了良好的抗原結(jié)合活性,并可成功殺傷人結(jié)腸癌細胞;在37℃及不同的溫度下孵育一定時間后,經(jīng)ELISA 測定,37℃孵育一周蛋白仍能保持活性基本不變。本研究首次成功構(gòu)建了B3ds-scFv-SEA(D227A)重組毒素,此蛋白具備了導(dǎo)向和殺傷腫瘤細胞的雙重功能,并且通過鏈間二硫鍵的引入大大提高了整個融合蛋白的穩(wěn)定性,為其發(fā)展為有效的腫瘤免疫治療靶向藥物奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:The concept of superantigen (supperantigen SAg) was first proposed by White in 1989, when a group of proteins encoded by bacteria or viruses could not be treated with antigen-presenting cell (APC). In the form of complete protein molecules, MHC class 鈪，

本文編號：2217922