發(fā)布時間：2018-09-01 17:06

【摘要】：AMPA受體介導了中樞神經(jīng)系統(tǒng)絕大部分快速型的興奮性突觸傳遞。在海馬中大部分AMPA受體是以含GluR2的異四聚體的形式存在。AMPA受體的裝配以一種“二聚化后二聚化”的模型進行裝配。雖然在離子型谷氨酸受體的首次裝配過程中,N末端結(jié)構(gòu)域(N terminal domain NTD)起了一定的作用,但是還不清楚在活細胞中和完整的受體中NTD的相互作用的情況。我們采用熒光檢測法包括雙分子熒光互補法(bimolecular fluorescence complementation BiFC)和熒光共振能量轉(zhuǎn)移法(Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET)。來研究NTD的相互作用。BiFC是熒光蛋白在合適的位點打開,并標記目標蛋白,當這兩片段標記的蛋白兩兩相互作用時,熒光蛋白能正確折疊并重建熒光團。為了方便后續(xù)的工作,我們首先構(gòu)建了胞漿型和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)型(endoplasmic reticulium ER)的表達載體。在HEK293和COS7細胞內(nèi)對游離的AMPA受體GluRl亞單位的NTD進行了雙分子熒光互補檢測,可見黃色的熒光。證實在活細胞中,無論在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中還是在胞漿中,它們都能形成二聚體。為了排除蛋白之間非特異性的相互作用,我們選用代謝性谷氨酸受體的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(metabotropicglutamate receptor ligand binding domain mGluRl-LBD)作為陰性對照,可見微弱的非特異的相互作用.。為了檢測在完整的受體中GluRl NTD的相互作用,采
[Abstract]:AMPA receptors mediate most of the fast excitatory synaptic transmissions in the central nervous system. In the hippocampus, most of the AMPA receptors are assembled in the form of heteropolymer containing GluR2. The assembly of AMPA-receptor is carried out in a model of "dimerization after dimerization". Although the N-terminal domain (N terminal domain NTD) plays a role in the first assembly of ionized glutamate receptors, it is unclear how NTD interacts in living cells and intact receptors. We use fluorescence detection methods including bimolecular fluorescence complementary method (bimolecular fluorescence complementation BiFC) and fluorescence resonance energy transfer method (Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET). To study the interaction of NTD. BiFC is a fluorescent protein opened at a suitable site and labeled with the target protein. When the two fragments of the labeled protein interact with each other, the fluorescent protein can fold and reconstruct the fluorescence clusters correctly. To facilitate further work, we first constructed cytoplasmic and endoplasmic reticulum type (endoplasmic reticulium ER) expression vectors. In HEK293 and COS7 cells, the NTD of the free AMPA receptor GluRl subunit was detected by bimolecular fluorescence complementary detection, and yellow fluorescence was observed. It is proved that in living cells, both in endoplasmic reticulum and in cytoplasm, they can form dimers. In order to eliminate the nonspecific interaction between proteins, we selected the ligand binding domain (metabotropicglutamate receptor ligand binding domain mGluRl-LBD) of metabolic glutamate receptor as negative control. In order to detect the interaction of GluRl NTD in intact receptors,
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2006
【分類號】：R33

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