發(fā)布時(shí)間：2018-09-01 11:05

【摘要】： 研究背景 1998年美國(guó)科學(xué)家先后從囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass,ICM)及原始生殖細(xì)胞(primordial germ cells, PGCs)中分離得到人ES細(xì)胞系(embryonic stem cells)和人EG細(xì)胞(embryonic germ cells)。它們?cè)隗w外具有的無(wú)限增殖和多向分化能力使其成為胚胎早期發(fā)育研究、細(xì)胞治療和組織工程等領(lǐng)域的重要工具。因此,明確其自我更新和多向分化的調(diào)控機(jī)制是胚胎干細(xì)胞廣泛應(yīng)用的前提。 PGCs是指在進(jìn)入與體細(xì)胞有密切接觸的生殖腺成為真正的生殖細(xì)胞之前,短暫存在于胚胎的雙倍體生殖細(xì)胞前體。從系統(tǒng)發(fā)育學(xué)的觀點(diǎn)來(lái)說(shuō),生殖細(xì)胞是至關(guān)重要的,因?yàn)樗休d著遺傳信息,并使之代代相傳,而體細(xì)胞則為生殖細(xì)胞提供保護(hù)和營(yíng)養(yǎng)。因而,只有了解生殖系從PGCs到成熟配子的發(fā)育過(guò)程才能洞悉人類胚胎發(fā)生的起源。從干細(xì)胞生物學(xué)的角度而言,原始生殖細(xì)胞是成熟配子的前體,將其看作干細(xì)胞是無(wú)可爭(zhēng)議的。 hEG細(xì)胞培養(yǎng)的困難相對(duì)較大。1998年至今僅少數(shù)幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室宣布獲得了hEG細(xì)胞,且至今尚未獲得可長(zhǎng)期培養(yǎng)的hEG細(xì)胞,因此優(yōu)化hEG細(xì)胞培養(yǎng)體系必將推動(dòng)其深入研究。hEG細(xì)胞的基本培養(yǎng)基中需添加多種細(xì)胞因子以維持其在未分化狀態(tài)下的增殖,包括白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor,LIF)、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Stem cell factor,SCF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Fibroblast growth factor, FGF)、Forskolin等。同時(shí),hEG細(xì)胞的生長(zhǎng)還依賴于飼養(yǎng)層細(xì)胞的支持。傳統(tǒng)培養(yǎng)體系中,飼養(yǎng)層主要采用小鼠成纖維細(xì)胞系STO或原代MEF,可能導(dǎo)致培養(yǎng)體系的鼠源性污染�？傊�,hEG細(xì)胞的深入研究和臨床應(yīng)用的前提是建立安全、有效的培養(yǎng)體系。本實(shí)驗(yàn)分離人5 9周流產(chǎn)胚胎生殖嵴,以表達(dá)LIF基因的人胚肺成纖維細(xì)胞(LIF-expressing human embryonic lung fibroblasts, hELF/lif)作為飼養(yǎng)層培養(yǎng)hEGC,并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定,旨在為hEG細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立和優(yōu)化奠定基礎(chǔ)。 自2003年以來(lái),已有實(shí)驗(yàn)室報(bào)道獲得ES細(xì)胞來(lái)源的生殖細(xì)胞。2004年底,Science期刊將“體外系統(tǒng)中ES細(xì)胞分化產(chǎn)生生殖細(xì)胞”的發(fā)現(xiàn)列為該年的十大突破進(jìn)展之一。由胚胎干細(xì)胞分化為生殖細(xì)胞,除為生殖系統(tǒng)發(fā)育提供可研究的模型外,無(wú)疑還將為獲得成體生殖細(xì)胞提供很好的材料,因此具有極大的理論和實(shí)際價(jià)值。特別的是,EG細(xì)胞作為生殖系本身來(lái)源的多能干細(xì)胞,將其作為向生殖細(xì)胞分化的種子細(xì)胞較ES細(xì)胞更為適合。此外在體內(nèi)發(fā)育過(guò)程中,PGCs遷移到生殖嵴,增殖到足夠數(shù)量后,即觸發(fā)減數(shù)分裂,分化為生殖系干細(xì)胞。但是,維持自我更新和觸動(dòng)分化過(guò)程中發(fā)揮作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,目前仍不清楚。由于原始生殖細(xì)胞缺乏特異性標(biāo)記,同時(shí)受標(biāo)本來(lái)源的限制,使得長(zhǎng)期以來(lái)對(duì)PGCs分化機(jī)制的研究較少。hEG細(xì)胞來(lái)源于生殖系統(tǒng),本實(shí)驗(yàn)將PGCs來(lái)源的hEG細(xì)胞進(jìn)行體外“順勢(shì)分化”,研究分化過(guò)程中多能干細(xì)胞標(biāo)記Oct4、Nanog,生殖系標(biāo)記Stella、VASA,減數(shù)分裂相關(guān)標(biāo)記SCP1、SCP3、GDF9、TEKT1的表達(dá),探討PGCs增殖分化機(jī)制。 研究結(jié)果 一、以轉(zhuǎn)染LIF基因的人胚肺成纖維細(xì)胞為飼養(yǎng)層培養(yǎng)人胚胎生殖細(xì)胞 原代來(lái)源的人胚肺成纖維細(xì)胞形態(tài)典型,增殖旺盛。LIF基因真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞經(jīng)G418篩選后得到可傳代陽(yáng)性克隆,經(jīng)RT-PCR和western-blot鑒定均能穩(wěn)定表達(dá)LIF。 分離5-9周胚胎生殖嵴細(xì)胞,種植到hELF/lif細(xì)胞制成的飼養(yǎng)層上,在培養(yǎng)基中不添加外源性LIF蛋白的條件下,PGCs來(lái)源的hEG細(xì)胞形成典型的鳥巢狀集落,集落呈高度的堿性磷酸酶活性,胚胎特異抗體SSEA-1、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81陽(yáng)性。表達(dá)未分化標(biāo)志Oct-4,Nanog和Rex-1,以及端粒酶活性標(biāo)記:hTERT。染色體分析培養(yǎng)25天后的細(xì)胞為正常人染色體核型。具有hEG細(xì)胞的形態(tài)學(xué)及生物學(xué)特性。免疫組化和免疫熒光分析發(fā)現(xiàn):14天EB表達(dá)組織特異性標(biāo)志Desmin和AFP。之后分別對(duì)未分化hEG細(xì)胞,第7天EB細(xì)胞和第14天EB細(xì)胞進(jìn)行的RT-PCR分析發(fā)現(xiàn):隨分化程度增加,EB細(xì)胞表達(dá)三個(gè)胚層來(lái)源細(xì)胞標(biāo)志,分別為內(nèi)胚層:α-FP,Pdx-1;中胚層:CD34,enolase;外胚層:Vimentin,NF68,表明hEG細(xì)胞具有向三個(gè)胚層分化的多向潛能。分別收集在hELF和hELF/lif細(xì)胞上生長(zhǎng)7天和10天的hEG細(xì)胞,進(jìn)行RT-PCR分析。hEG細(xì)胞中能檢測(cè)到LIFR的表達(dá),但僅在hELF/lif細(xì)胞上生長(zhǎng)的hEG細(xì)胞中檢測(cè)到LIF信號(hào)通路靶基因c-myc的表達(dá),提示在hELF/lif飼養(yǎng)層上生長(zhǎng)的hEG細(xì)胞中LIF信號(hào)通路被激活。 二、hEG細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化及其調(diào)控機(jī)制 RT-PCR的方法分析表明:未分化hEG細(xì)胞有較高水平的Oct4和Nanog表達(dá),而hEG細(xì)胞一旦分化形成為EB(Day3),Nanog表達(dá)水平立即顯著下降,并隨進(jìn)一步分化下降到檢測(cè)不到的水平。而Oct4在hEG細(xì)胞分化后表達(dá)水平下降,但仍保持一定的表達(dá)。生殖系標(biāo)志分子STELLA,PGCs細(xì)胞后期(遷移到生殖嵴,減數(shù)分裂前)階段特異性基因VASA從EB形成第7天被檢測(cè)到,表達(dá)水平持續(xù)上升,同時(shí),卵母細(xì)胞特異性基因GDF9和精原細(xì)胞特異性基因TEKT1分別從EB形成第3天,和EB形成第7天開始被檢測(cè)到。減數(shù)分裂標(biāo)志SCP1在EB中也被檢測(cè)到。 對(duì)hEG細(xì)胞和EB進(jìn)行免疫熒光分析發(fā)現(xiàn):未分化hEG細(xì)胞胞漿表達(dá)Nanog,而EB中表達(dá)減數(shù)分裂標(biāo)志分子SCP3的細(xì)胞的Nanog表達(dá)是缺失的。分別對(duì)第7周胚胎和第13周男性及女性胚胎生殖嵴進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明:Nanog在PGCs遷移發(fā)育階段(第7周)大量表達(dá);而PGCs到達(dá)生殖嵴后,男性生殖細(xì)胞停滯在有絲分裂階段,女性生殖細(xì)胞在進(jìn)入減數(shù)分裂(第13周)后Nanog的表達(dá)立即下降到檢測(cè)不到的水平。因此,Nanog在抑制胚胎生殖細(xì)胞分化中可能發(fā)揮重要作用。Nanog表達(dá)下調(diào)是體內(nèi)觸動(dòng)生殖細(xì)胞減數(shù)分裂的必要條件,而體外受Oct4轉(zhuǎn)錄調(diào)控的Nanog表達(dá)水平下降可能是促進(jìn)hEG細(xì)胞分化的直接原因。上述結(jié)果顯示本培養(yǎng)體系中的hEG細(xì)胞具有向生殖細(xì)胞分化的能力,并具有減數(shù)分裂的潛能。 結(jié)論 原始生殖細(xì)胞是成體生殖細(xì)胞的前體,而成體配子融合又將形成受精卵,從而啟動(dòng)胚胎發(fā)育全過(guò)程,因此PGCs攜帶遺傳信息起著傳承生命的作用,在胚胎發(fā)育中具有至關(guān)重要的地位,同時(shí)又作為體外培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞的來(lái)源之一,具有臨床應(yīng)用的巨大潛力。國(guó)內(nèi)外科研工作者圍繞維持PGCs未分化狀態(tài)及多能性的分子調(diào)節(jié)機(jī)制作了大量研究,但具體機(jī)制仍不清楚。進(jìn)一步探討hEG細(xì)胞自我更新及分化過(guò)程中關(guān)鍵因子的功能,具有發(fā)育生物學(xué)和干細(xì)胞治療學(xué)的雙重意義。 建立無(wú)異種動(dòng)物成分污染的培養(yǎng)系統(tǒng)是胚胎干細(xì)胞技術(shù)發(fā)展的必然趨勢(shì)。本研究將LIF基因轉(zhuǎn)入hELF細(xì)胞中,建立人來(lái)源的能分泌LIF活性蛋白的新的飼養(yǎng)層來(lái)支持人hEG細(xì)胞的體外生長(zhǎng)。為優(yōu)化hEG細(xì)胞培養(yǎng)體系奠定基礎(chǔ)。在此過(guò)程中獲得人LIF基因真核表達(dá)載體、穩(wěn)定表達(dá)LIF的人胚肺成纖維細(xì)胞等材料也可成為多功能細(xì)胞因子LIF功能的研究工具。 本實(shí)驗(yàn)關(guān)于hEG細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化過(guò)程中分子表達(dá)變化的研究,為人類生殖系統(tǒng)發(fā)育這一長(zhǎng)期困擾生物界的難題提供了線索,也為重要轉(zhuǎn)錄因子在胚胎干細(xì)胞自我更新中的作用研究提供了證據(jù)。在本研究前期建立的以hELF/lif飼養(yǎng)層為基礎(chǔ)的hEG細(xì)胞培養(yǎng)體系中生長(zhǎng)的hEG細(xì)胞,分化形成EB,表達(dá)生殖細(xì)胞和減數(shù)分裂標(biāo)志分子,具有向生殖細(xì)胞分化的潛能。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R321.1

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本文編號(hào)：2217001