【摘要】：Cole 等人在 1998 年發(fā)表了結(jié)核分枝桿菌 (Mycobacteriumtuberculosis) H37Rv 菌株的基因組序列和基因組注釋,Camus 等人在2002 年 對(duì) H37Rv 菌株的基因組注釋進(jìn)行了修正。H37Rv 菌株的基因組信息為我們深入了解結(jié)核病原菌的致病機(jī)理及研發(fā)新的抗結(jié)核藥物提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。H37Rv 菌株基因組的全長為 4411532 bp,含有4044 個(gè)基因,按功能分為 11 類,其中 272 個(gè)基因編碼未知功能的蛋白質(zhì),1051 個(gè)基因編碼具有保守序列的假定蛋白質(zhì) (Conservedhypothetical protein)。 細(xì)胞壁是結(jié)核分枝桿菌賴以生存和增殖的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),可作為研發(fā)抗結(jié)核新藥的靶標(biāo),因此,鑒定新的與細(xì)胞壁代謝有關(guān)的蛋白質(zhì)及酶,有助于我們深入了解細(xì)胞壁的生物合成及分解代謝規(guī)律及確定新的藥物作用靶標(biāo)。 聚阿拉伯糖聚半乳糖 (Arabinogalactan, AG) 是分枝桿菌細(xì)胞壁特有的結(jié)構(gòu),由 D-Galf 形成的聚半乳糖和 D-Araf 形成的聚阿拉伯糖構(gòu)成。目前,尚未完全了解聚阿拉伯糖及聚半乳糖生物合成過程中的一些細(xì)節(jié)。參與聚阿拉伯糖合成的糖基供體是聚十異戊二烯磷酸阿拉伯糖 (Decaprenyl-phospho-arabinose,DPA),但對(duì) DPA 形成的詳細(xì)過程缺乏認(rèn)識(shí),DPA 合成途徑可能有轉(zhuǎn)移酶、磷酸酶和差向異構(gòu)酶參與。Huang 等人已鑒定出結(jié)核分枝桿菌的 Rv3806c 基因產(chǎn)物具有轉(zhuǎn)移酶活性。馬郁芳教授從結(jié)核分枝桿菌中克隆了編碼差向異構(gòu)酶的侯選基因并正在鑒定其功能。因此,對(duì)磷酸酶功能的鑒定便于我們?nèi)媪私?2 結(jié)核分枝桿菌中 DPA 形成的機(jī)制。 Rv3813c 基因編碼保守的假定蛋白質(zhì) (Conserved hypothetical protein),利用 NCBI 的 Conserved Domain Search Tool 和 Conserved Domain Architecture Retrieval Tool 分析 Rv3813c 編碼的蛋白質(zhì),發(fā)現(xiàn) Rv3813c 蛋白質(zhì)具有水解酶或磷酸酶的保守的結(jié)構(gòu)域,因此,本論文 的目的是 (1) 用 PCR 方法從結(jié)核分枝桿菌 H37Rv 基因組中擴(kuò)增 Rv3813c 基因;(2) 克隆 Rv3813c 基因并測定其核苷酸序列;(3) 構(gòu) 建表達(dá)質(zhì)粒 pET29b-Tb Rv3813c;(4) 優(yōu)化 Rv3813c 蛋白質(zhì)在大腸桿 菌 BL21(DE3) 中的表達(dá);(5) 純化 Rv3813c 蛋白質(zhì)并對(duì)純化的 Rv3813c 蛋白質(zhì)進(jìn)行功能鑒定。 本論文所獲得結(jié)果如下: 1. 用 PCR 方法擴(kuò)增 Rv3813c 基因 從 結(jié) 核 分 枝 桿 菌 H37Rv 菌 株 基 因 組 數(shù) 據(jù) 庫 (http: //genolist.pasteur.fr/Tuberculist/) 中獲得 Rv3813c 基因的核苷酸序列, 根據(jù)此序列設(shè)計(jì) PCR 引物,并在上游引物 Rv3813c-1 和下游引物 Rv3813c-2 的 5’ 端中分別引入 NdeI 和XhoI 位點(diǎn),利用 Vent DNA 聚合酶成功地從 H37Rv 菌株基因組 DNA 中擴(kuò)增了 Rv3813c 基因 。 2. 克隆 Rv3813c 基因和測定其核苷酸序列 將 Rv3813c PCR 產(chǎn)物克隆到 pSTBlue1 克隆質(zhì)粒中,構(gòu)建出 pSTBlue1- Rv3813c 重組質(zhì)粒。對(duì) pSTBlue1-Rv3813c (5) 的 Rv3813c 基因進(jìn)行 DNA 序列測定,結(jié)果表明用 PCR 方法擴(kuò)增的 Rv3813c 基 因與 H37Rv 菌株基因組數(shù)據(jù)庫中的 Rv3813c 基因有完全一致的核 苷酸序列,即所克隆的 Rv3813c 基因中不存在任何堿基突變。 3. 構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒 pET29b-Tb Rv3813c 用 NdeI 和 XhoI 雙 酶 切 pSTBlue1-Rv3813c (5) 而 獲 得 Rv3813c 基因,將純化 Rv3813c 基因克隆到 pET29b 的 NdeI 和 XhoI 位點(diǎn),構(gòu)建出 pET29b- Rv3813c 表達(dá)質(zhì)粒,Rv3813c 基因表達(dá) 的 Rv3813c 蛋白質(zhì),其 C 端與來自表達(dá)質(zhì)粒的組氨酸標(biāo)簽 (6 個(gè)組 氨酸) 形成融合蛋白,便于 Rv3813c 蛋白質(zhì)的鑒定及純化。 3 4. Rv3813c 蛋白質(zhì)在大腸桿菌 BL21(DE3) 中的表達(dá) (1) 用表達(dá)質(zhì)粒 pET29b-Tb Rv3813c (5) 轉(zhuǎn)化 BL21(DE3)。 (2) 在 37°C 條件下用 1 mM IPTG 誘導(dǎo) pET29b-Rv3813c/BL21 (DE3),用 SDS-PAGE 電泳及 Western blot 方法檢測和鑒定 Rv3813c 基因的表達(dá)產(chǎn)物。結(jié)果顯示,Rv3813c 基因能高表達(dá)出 Rv3813c 蛋白 質(zhì)。 5. Rv3813c 蛋白質(zhì)的純化及酶活性測定 (1) 用組氨酸-鎳親和層析凝膠 (HIS-Select HF Nickel Affinity Gel) 純化 Rv3813c 蛋白質(zhì),用 SDS-PAGE 電泳及 Western blot 方法檢測 并鑒定每管洗脫液 (共 5 管) 中的 Rv3813c 蛋白質(zhì)。結(jié)果顯示,第一 管洗脫液中含有極少量的雜蛋白,其余 4 管洗脫液中沒有出現(xiàn)雜蛋 白,說明組氨酸-鎳親和層析方法能有效地純化 Rv3813c 蛋白質(zhì)。對(duì) 純化的 Rv3813c 蛋白質(zhì)進(jìn)行脫鹽和脫咪唑后,測定其酶活性。 (2) 測定磷酸酶活性:pNPP 法 用 0.45 μg Rv3813c 蛋白質(zhì)與 1 mM pNPP 在 200 μl 反應(yīng)體系 中進(jìn)行反應(yīng),在 550 nm 處測定其光吸收值,并計(jì)算出磷酸酶活性。 酶活性 = 18.3 x 2 x 10-7 x 109 x Absorbance/0.45 μg/30 min = 7.45 x 103 nmol/mg/min (3) 測定磷酸酶活性:利用 DP、PRPP 及轉(zhuǎn)移酶測定磷酸酶活性 將純化的 Rv3813c 蛋白質(zhì)與 DP (聚十異戊二烯磷酸)、14C 標(biāo)記 的 PRPP (磷酸核糖焦磷酸) 和高表達(dá)的轉(zhuǎn)移酶 (Rv3806c) 進(jìn)行孵育, 用薄板層析方法分析所生成的產(chǎn)物。結(jié)果顯示,反應(yīng)體系中由轉(zhuǎn)
[Abstract]:Cole et al. published the genome sequence and annotation of Mycobacterium tuberculosis H37Rv strain in 1998. Camus et al. revised the genome annotation of H37Rv strain in 2002. The genome information of H37Rv strain provides us with insight into the pathogenesis of tuberculosis and new research and development. Antituberculosis drugs provide a solid foundation. The genome of H37Rv strain is 441 1532 BP in length and contains 4044 genes. It is divided into 11 groups according to its function. Of these, 272 genes encode proteins with unknown function and 1051 genes encode conserved hypothetical protein.
Cell wall is the structural basis for the survival and proliferation of Mycobacterium tuberculosis, and can be used as a target for the development of new anti-tuberculosis drugs. Therefore, identifying new proteins and enzymes related to cell wall metabolism is helpful for us to understand the rules of cell wall biosynthesis, degradation and metabolism and to identify new drug targets.
Arabinogalactan (AG) is a unique structure of the cell wall of Mycobacterium. It is composed of D-Galf-formed polygalactose and D-Araf-formed polyarabinose. Decaprenyl-phospho-arabinose (DPA) is a polyisoprene phospho-arabinose (DPA), but the detailed process of DPA formation is poorly understood. DPA synthesis pathways may involve transferases, phosphatases and differential isomerases. Huang et al. have identified Rv3806c gene product of Mycobacterium tuberculosis as having transferase activity. The candidate genes encoding the differential isomerase have been cloned from Mycobacterium nucleus and their functions are being identified.
Two
The mechanism of DPA formation in Mycobacterium tuberculosis.
The Rv3813c gene encodes a conservative putative protein (Conserved hypothetical).
Protein), using NCBI's Conserved Domain Search Tool and Conserved
Domain Architecture Retrieval Tool analysis of Rv3813c encoded proteins, found
Rv3813c protein has a conserved domain of hydrolases or phosphatase, so this paper
The purpose is (1) to amplify the H37Rv genome from Mycobacterium tuberculosis by PCR.
Rv3813c gene; (2) Rv3813c gene was cloned and its nucleotide sequence was determined; (3) construction.
Construct expression plasmid pET29b-Tb Rv3813c; (4) optimize Rv3813c protein in colon tube
Expression of bacteria BL21 (DE3); (5) purification of Rv3813c protein and purification.
The function of Rv3813c protein was identified.
The results obtained in this paper are as follows:
1. amplification of Rv3813c gene by PCR.
From the genomic database of Mycobacterium tuberculosis H37Rv (http:)
The nucleotide sequence of Rv3813c gene was obtained from //genolist.pasteur.fr/Tuberculist/.
Based on this sequence, PCR primers were designed, and primers Rv3813c-1 and downstream primers were used.
NdeI and XhoI sites were introduced into the 5 'end of Rv3813c-2, respectively, using Vent DNA.
Polymerase has successfully amplified the Rv3813c gene from genomic DNA of H37Rv strain.
2. cloning of Rv3813c gene and determination of its nucleotide sequence
The Rv3813c PCR product was cloned into pSTBlue1 clone plasmid and constructed.
PSTBlue1- Rv3813c recombinant plasmid. Rv3813c for pSTBlue1-Rv3813c (5)
The DNA sequence of the gene was analyzed, and the results showed that Rv3813c was amplified by PCR.
Because the Rv3813c gene is completely consistent with the H37Rv genome database.
There is no nucleotide mutation in the Rv3813c gene, which is cloned.
3. construction of expression plasmid pET29b-Tb Rv3813c
NdeI and XhoI were digested by pSTBlue1-Rv3813c (5).
Rv3813c gene, the purified Rv3813c gene was cloned into NdeI and pET29b.
XhoI locus, pET29b- Rv3813c expression plasmid was constructed and Rv3813c gene expression was constructed.
The Rv3813c protein and its C end were labeled with histidine from the expression plasmid (6 groups).
The fusion protein was formed to facilitate the identification and purification of Rv3813c protein.
Three
Expression of 4. Rv3813c protein in Escherichia coli BL21 (DE3)
(1) BL21 (DE3) was transformed by expression plasmid pET29b-Tb Rv3813c (5).
(2) induction of pET29b-Rv3813c/BL21 with 1 mM IPTG at 37 C.
(DE3) detection and identification of Rv3813c by SDS-PAGE electrophoresis and Western blot.
The results showed that Rv3813c gene could express Rv3813c protein highly.
Quality.
Purification of 5. Rv3813c protein and determination of its enzyme activity
(1) use histidine nickel affinity chromatography gel (HIS-Select HF Nickel Affinity Gel).
Purified Rv3813c protein was detected by SDS-PAGE electrophoresis and Western blot method.
The Rv3813c protein of each eluent (a total of 5 tubes) was identified.
There was a small amount of miscellaneous protein in the eluent, and there was no miscellaneous egg in the other 4 tubes.
It shows that histidine nickel affinity chromatography can effectively purify Rv3813c protein.
The purified Rv3813c protein was desalted and deimidazole to determine its enzyme activity.
(2) determination of phosphatase activity: pNPP method
The reaction system was 0.45 micron g Rv3813c and 1 mM pNPP at 200 L.
The reaction was performed at 550 nm and the phosphatase activity was calculated.
Enzyme activity = 18.3 x 2 x 10-7 x 109 x Absorbance/0.45 g/30 min
= 7.45 x 103 nmol/mg/min
(3) determination of phosphatase activity: Determination of phosphatase activity by DP, PRPP and transferase
The purified Rv3813c protein was labeled with DP (poly ten isoprenoid phosphate) and 14C.
PRPP (ribose pyrophosphate) and high expression transferase (Rv3806c) were incubated.
The products were analyzed by thin layer chromatography.
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號(hào)】：Q78

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本文編號(hào)：2216989