【摘要】：骨保護素(osteoprotegerin,OPG)是破骨細胞分化因子(receptor activator of nuclear factor-κ B ligand,RANKL)的可溶性“誘騙”受體,能抑制破骨細胞的分化、成熟、活化及存活。它是一種分泌性糖蛋白,含21個信號肽和5個潛在的糖基化位點。成熟人OPG由7個結構域組成,其中N-端有4個半胱氨酸富集結構,也是其生物活性所在部位。最初OPG以單體形式在細胞內生成,再在第400個半胱氨酸(Cys400)的位置以二硫鍵連成二聚體。 目前,雖有原核表達OPG的報道,但仍存在一些不足。例如,在大腸桿菌中表達真核蛋白,不能進行翻譯后修飾,諸如不能完成蛋白的糖基化、磷酸化和二硫鍵的形成等,所以很難制得具備天然活性的蛋白質。真核細胞能夠表達具有生物功能的OPG,但存在的普遍問題是表達量不高。近年本室成功構建了OPG的真核表達載體pcDNA3.1/DHFR-OPG,轉染CHO-dhfr~-細胞后獲得了表達,但表達量不高,不能滿足后續(xù)實驗的需要。本次研究在于進一步優(yōu)化已建立好的表達系統(tǒng),并進一步對表達產物進行免疫原性鑒定和生物活性測定。 本次研究將通過對目的基因和載體結構進行改進,以達到優(yōu)化表達的目的。在已有全長型人OPG重組哺乳類表達載體pcDNA3.1/DHFR-OPG的基礎上,利用PCR技術擴增截短型人OPGcDNA(含有21個信號肽序列、D1-D4結構區(qū)和形成二硫鍵必需的Cys400),利用限制性內切酶EcoR Ⅰ將其克隆入構建好的帶有二氫葉酸還原酶篩選標記的哺乳類表達載體pcDNA3.1/DHFR-GFP的相應克隆位點,構建成pcDNA3.1/DHFR-tOPG。并嘗試對載體進行優(yōu)化,以截短型OPG為模板,運用兩次PCR技術,在目的基因的5'端非翻譯區(qū)添加了一條長35bp的翻譯增強序列和一條長37bp的內含子序列,構建了表達載體pcDNA3.1/DHFR-netOPG。 按照Lipofectmine~(TM)2000 Reagent說明書將上述已線性化載體分別轉入二氫葉酸還原酶(Dihydrofolate Reductase,DHFR)基因缺陷的CHO細胞中,首先在
[Abstract]:Osteoprotegerin (osteoprotegerin, OPG) is a osteoclast differentiation factor (receptor activator of).
Nuclear factor-kappa B ligand (RANKL), a soluble "decoy" receptor, inhibits the differentiation, maturation, activation and survival of osteoclasts. It is a secretory glycoprotein containing 21 signal peptides and 5 potential glycosylation sites. Mature human OPG consists of seven domains, of which the N-terminal has four cysteine-rich structures and is also bioactive. Location. OPG is initially formed as a monomer in the cell and then linked to a dimer at the 400 th cysteine (Cys400) site by disulfide bonding.
For example, the expression of eukaryotic proteins in E. coli can not be modified after translation, such as glycosylation, phosphorylation and disulfide bond formation, so it is difficult to produce naturally active proteins. In recent years, we successfully constructed the eukaryotic expression vector pcDNA3.1/DHFR-OPG of OPG and transfected CHO-dhfr~ - cells to express OPG, but the expression level was not high enough to meet the needs of subsequent experiments. The immunogenicity and biological activity of the substance were determined.
Based on the existing full-length human OPG recombinant mammalian expression vector pcDNA3.1/DHFR-OPG, the truncated human OPG cDNA (containing 21 signal peptide sequences, D1-D4 domain and Cys400 essential for disulfide bond formation) was amplified by PCR. The restriction endonuclease EcoR I was cloned into the corresponding cloning site of the mammalian expression vector pcDNA3.1/DHFR-GFP with dihydrofolate reductase screening marker and constructed into pcDNA3.1/DHFR-tOPG. The expression vector pcDNA3.1/DHFR-netOPG was constructed by adding a 35 BP translation enhancement sequence and a 37 BP intron sequence.
According to the Lipofectmine ~ (TM) 2000 Reagent specification, these linearized vectors were transferred into CHO cells with dihydrofolate reductase (DHFR) gene defect, first in
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2006
【分類號】：R346

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 劉繼中,胡蘊玉,紀宗玲,陳蘇民,朱幫福,陶惠人;人骨形成蛋白-2和骨保護素在小鼠成肌細胞中的共表達[J];中國修復重建外科雜志;2003年01期

2 吳偉立,方宏清,徐金森,陳惠鵬;骨保護素的研究進展[J];中國康復醫(yī)學雜志;2004年11期

3 楊召,楊華,姚振強,李宏鈞;雌激素對去卵巢大鼠松質骨中骨保護素mRNA表達的影響[J];中國矯形外科雜志;2003年06期

4 楊麗元;管思明;;骨保護素在血管鈣化中的作用[J];國際心血管病雜志;2007年05期

5 馬曉燁;呂安康;陸林;范小明;吳祁紅;楊二麗;許燕;;血清骨保護素水平與冠心病患者肺動脈高壓的相關性研究[J];診斷學理論與實踐;2011年02期

6 郭海玲;趙詠芳;王翔;徐宇;詹紅生;;淫羊藿苷對人成骨細胞增殖及OPG蛋白表達的實驗研究[J];中國骨傷;2011年07期

7 徐琳,譚穎徽,何海濤,候延華;降鈣素基因相關肽對成骨細胞核因子-κB受體活化因子配體及其餌受體表達的影響[J];西北國防醫(yī)學雜志;2005年04期

8 歐三桃;黃頌敏;;骨保護素與血管鈣化[J];醫(yī)學綜述;2007年14期

9 張冬根;王冬英;劉和平;蔣小芽;;下頜骨骨折愈合過程中骨保護素表達的免疫組化研究[J];華北煤炭醫(yī)學院學報;2007年04期

10 楊光;張君濤;王平;;骨保護素基因多態(tài)性的研究進展[J];中國中醫(yī)骨傷科雜志;2007年11期

相關會議論文 前10條

1 石義剛;陶天遵;李曉蕊;吳瑩;劉楓晨;王立春;吉光榮;吳麗萍;徐強;;rhIGF-1對成骨細胞增殖、分化及骨保護素、骨保護素配體基因mRNA表達的影響[A];第五次全國創(chuàng)傷康復暨第七次全國運動療法學術會議論文匯編[C];2004年

2 楊艷;龔云輝;倪姍姍;周斌;宋亞萍;張林;周容;;骨保護素基因多態(tài)性與重度子癇前期的關系[A];中華醫(yī)學會第三次全國妊娠期高血壓疾病學術研討會論文匯編[C];2011年

3 石義剛;陶天遵;李曉蕊;劉楓晨;王立春;吉光榮;吳麗萍;徐強;;rhIGF-1對成骨細胞增殖、分化及骨保護素、骨保護素配體基因mRNA表達的影響[A];中華醫(yī)學會第三次全國骨質疏松和骨礦鹽疾病學術會議暨骨質疏松診斷技術繼續(xù)教育學習班論文匯編[C];2004年

4 潘時中;;骨保護素在雌性去勢大鼠不同時期骨組織的表達[A];老齡問題研究論文集（十四）——積極老齡化研究之六——健康與老齡化[C];2010年

5 楊林;陶天遵;吳瑩;張旗濤;于友;張淑云;劉偉;吳麗萍;王新婷;;骨保護素和骨保護素配體在人骨髓基質細胞向成骨細胞分化過程中的表達及地塞米松和中藥Genis對其表達的影響(摘要)[A];第五次全國創(chuàng)傷康復暨第七次全國運動療法學術會議論文匯編[C];2004年

6 楊林;陶天遵;李曉蕊;張旗濤;于友;張淑云;劉偉;吳麗萍;王新婷;;骨保護素 骨保護素配體在人骨髓基質細胞向成骨細胞分化過程中的表達及地塞米松和中藥Genis對其表達的影響[A];中華醫(yī)學會第三次全國骨質疏松和骨礦鹽疾病學術會議暨骨質疏松診斷技術繼續(xù)教育學習班論文匯編[C];2004年

7 龐小芬;高利紅;;骨保護素蛋白對骨質疏松及血管鈣化作用機制的研究[A];中華醫(yī)學會第六次全國骨質疏松和骨礦鹽疾病學術會議暨中華醫(yī)學會骨質疏松和骨礦鹽疾病分會成立十周年論文匯編[C];2011年

8 劉虎;徐又佳;;鐵調素對MC3T3-E1小鼠成骨細胞骨保護素和骨鈣素基因表達的影響[A];中華醫(yī)學會第六次全國骨質疏松和骨礦鹽疾病學術會議暨中華醫(yī)學會骨質疏松和骨礦鹽疾病分會成立十周年論文匯編[C];2011年

9 石義剛;陶天遵;吳瑩;陶樹清;曲國藩;吳麗萍;;細胞因子、激素調節(jié)骨保護素和骨保護素配體基因表達及破骨細胞功能的研究進展[A];中華醫(yī)學會第三次全國骨質疏松和骨礦鹽疾病學術會議暨骨質疏松診斷技術繼續(xù)教育學習班論文匯編[C];2004年

10 石義剛;陶天遵;陶樹清;曲國藩;吳麗萍;;rhIGF-1對成骨細胞增殖、分化及骨保護素、骨保護素配體基因mRNA表達的影響[A];第五次全國創(chuàng)傷康復暨第七次全國運動療法學術會議論文匯編[C];2004年

相關博士學位論文 前10條

1 張忠民;血小板衍生生長因子（PDGF）對去勢大鼠骨與關節(jié)的生物學作用及機理的實驗研究[D];第一軍醫(yī)大學;2002年

2 萬方;骨保護素對血管平滑肌細胞的保護性作用及其機制研究[D];中南大學;2011年

3 戴芳;人骨保護素cDNA的克隆與表達[D];天津醫(yī)科大學;2004年

4 陳海昕;骨保護素在前列腺癌骨轉移中作用的基礎與臨床研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2007年

5 侯樂樂;雞骨保護素真核質粒pcDNA3.1（+）-chOPG的構建及其在蛋雞體內、外表達及功能的研究[D];南京農業(yè)大學;2011年

6 劉繼中;人骨保護素的表達及生物活性研究[D];中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學;2003年

7 唐華;人骨保護素質粒轉染抑制大鼠實驗性牙周炎骨吸收的研究[D];四川大學;2007年

8 歐三桃;DN大鼠腎內小動脈早期骨基質蛋白的表達及非洛地平對其作用的實驗研究[D];四川大學;2007年

9 姚靜;雞骨保護素（chOPG）基因的克隆、表達及生物學活性研究[D];南京農業(yè)大學;2007年

10 許躍;下頜骨單側前上牽引力對大鼠顳下頜關節(jié)影響的初步研究[D];四川大學;2006年

相關碩士學位論文 前10條

1 闞伯紅;截短型人骨保護素哺乳類載體的構建、優(yōu)化及表達[D];天津醫(yī)科大學;2006年

2 譚艷飛;成年人瘦素和骨保護素的參考值及其種族差異和性別差異[D];中南大學;2010年

3 楊偉;骨保護素對臍靜脈內皮細胞生長的研究[D];華中科技大學;2010年

4 李偉力;骨保護素基因多態(tài)性與頸動脈鈣化的相關性研究[D];青島大學;2012年

5 崔蓮;延邊地區(qū)2型糖尿病血清骨保護素與骨密度變化及其相關因素的研究[D];延邊大學;2011年

6 鄧大慶;骨保護素對大鼠血管平滑肌細胞凋亡的影響及其機理研究[D];南華大學;2010年

7 王小斌;血清骨保護素水平與冠狀動脈病變關系的研究[D];南京醫(yī)科大學;2004年

8 楊春愛;骨保護素基因啟動子多態(tài)性與2型糖尿病骨質疏松的關系[D];昆明醫(yī)科大學;2012年

9 徐美林;多元回歸法分析血清骨保護素與冠心病患者冠狀動脈病變狹窄程度的關系及相關影響因素[D];安徽醫(yī)科大學;2012年

10 裘靜英;骨保護素在絕經婦女2型糖尿病骨質疏松中的作用[D];浙江大學;2012年

，

本文編號：2209699