【摘要】：胚胎干細(xì)胞(ESC)誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞的體外模型類似早期的胚胎發(fā)育模式,利用此模型,輔之以分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)及免疫學(xué)等技術(shù)手段,可以有效進(jìn)行神經(jīng)發(fā)生分化及一些遺傳性神經(jīng)致病機(jī)制的研究。胚體(EBs)是ESC分化前形成的團(tuán)聚體,在ESC神經(jīng)分化過(guò)程中具有承前啟后的作用,EBs內(nèi)細(xì)胞的周期狀態(tài)與誘導(dǎo)分化的關(guān)系未見(jiàn)報(bào)道。無(wú)血清培養(yǎng)方法誘導(dǎo)神經(jīng)分化過(guò)程中,堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)是EBs貼壁后誘導(dǎo)分化階段必須添加的生長(zhǎng)因子,bFGF可能在ESC神經(jīng)誘導(dǎo)分化階段發(fā)揮神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用,但由于bFGF能觸發(fā)體外培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元釋放興奮性遞質(zhì)谷氨酸(Glu),故也可能在神經(jīng)誘導(dǎo)分化階段發(fā)揮神經(jīng)刺激興奮性的作用。利用ESC誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞的體外模型可以從神經(jīng)發(fā)育學(xué)的角度分析阿爾茨海默癥(AD)的發(fā)生機(jī)制,尤其是神經(jīng)元從分化發(fā)生到凋亡或死亡的發(fā)育模式,為我們?cè)隗w外研究β-淀粉樣蛋白(Aβ)對(duì)不同年齡階段神經(jīng)元的影響提供了可能。 首先,建立了基于本實(shí)驗(yàn)室條件下的ESC誘導(dǎo)分化神經(jīng)元細(xì)胞方法體系。我們?cè)贐ain“4+/4-”RA誘導(dǎo)法的基礎(chǔ)上,對(duì)小鼠D3系ESC采用“2+2”(即懸滴培養(yǎng)2天再懸浮培養(yǎng)兩天)的培養(yǎng)方式形成EBs,全反式維甲酸(RA)誘導(dǎo)的ESC在體外分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞,并初步分析了ESC誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元細(xì)胞生物學(xué)特性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),我們誘導(dǎo)ESC分化產(chǎn)生了谷氨酸能的神經(jīng)元細(xì)胞,通過(guò)RT-PCR分析鑒定,這類神經(jīng)元細(xì)胞表達(dá)了NMDA受體亞型;使用熒光分子探針標(biāo)記發(fā)現(xiàn),分化的神經(jīng)元細(xì)胞能夠被Glu刺激后開(kāi)放NMDA受體通道,使胞內(nèi)鈣離子濃度升高,并被NMDA受體拮抗劑MK801阻斷。 其次,通過(guò)探索不同周期時(shí)相ESC對(duì)EBs形成的影響、不同增殖狀態(tài)ESC對(duì)神經(jīng)分化的影響等,確立ESC的細(xì)胞周期狀態(tài)與EBs的結(jié)構(gòu)形成的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)血清饑餓同步化可以增強(qiáng)EBs的分化潛能性。通過(guò)血清饑餓、脫氧胸苷和秋水仙素阻斷法分別有效地將ESC阻斷在G0/G1、G1/S、G2/M相,研究了同步化后的細(xì)
[Abstract]:The model of embryonic stem cell (ESC) induced differentiation into neuronal cells in vitro is similar to the early embryonic development model, which is supplemented by molecular biology, cell biology and immunology, etc. It can effectively study the neurogenesis and differentiation and some genetic neuropathogenetic mechanisms. Embryonic (EBs) is an agglomerate formed before differentiation of ESC. The relationship between cell cycle state and induction of differentiation in ESC neural differentiation is not reported. In the process of nerve differentiation induced by serum-free culture, basic fibroblast growth factor (bFGF), which must be added in the stage of differentiation induced by EBs after adhesion, may play a neurotrophic role in the stage of nerve differentiation induced by ESC. However, bFGF can trigger the release of excitatory neurotransmitter glutamate (Glu), from cultured cortical neurons in vitro, so it may also play an excitatory role in neuronal induction and differentiation. The in vitro model of differentiation into nerve cells induced by ESC can be used to analyze the mechanism of (AD) in Alzheimer's disease from the perspective of neurogenesis, especially the developmental pattern of neurons from differentiation to apoptosis or death. It is possible for us to study the effect of 尾 -amyloid protein (A 尾) on neurons at different age stages in vitro. Firstly, the method system of ESC induced differentiation neuron cells was established under the condition of our laboratory. On the basis of Bain "4 / 4-" RA induction, we used "22" (2 days suspension culture) to form ESC induced by EBs, all-trans retinoic acid (RA) to differentiate into neuron-like cells in vitro. The biological characteristics of neuronal cells induced by ESC were preliminarily analyzed. The results showed that we induced ESC to differentiate into glutamatergic neuronal cells, which were identified by RT-PCR analysis and expressed NMDA receptor subtypes. The differentiated neurons were stimulated by Glu to open up NMDA receptor channels, which increased intracellular calcium concentration and were blocked by NMDA receptor antagonist MK801. Secondly, the relationship between the cell cycle state of ESC and the structure of EBs was established by exploring the effect of ESC on the formation of EBs and the effect of ESC on neural differentiation in different proliferative states. It was found that synchronization of serum starvation could enhance the differentiation potential of EBs. Serum starvation, deoxythymidine and colchicine blocking of ESC in G _ 0 / G _ 1 / S _ 1 / S _ 1 / G _ 2 / M phase were used to study the synchronized fineness.
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號(hào)】：R329.2

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2209426