【摘要】： 研究背景TNFα是一種具有復(fù)雜生物活性的細(xì)胞因子,它主要由巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞產(chǎn)生。該分子除了能夠在體內(nèi)或體外殺傷腫瘤細(xì)胞外,還具有抗病毒感染、激活巨噬細(xì)胞及多形核粒細(xì)胞、促進(jìn)組織相容性抗原表達(dá)、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫機(jī)能等多種功能。但是當(dāng)腫瘤壞死因子過量表達(dá)時(shí),它與其它炎癥因子一起產(chǎn)生多種病理?yè)p傷,如自身免疫性疾病,感染性疾病,惡液質(zhì)等。因此,中和體內(nèi)過量的TNFα,可為上述疾病的治療提供一條有效途徑。目前臨床上通過中和體內(nèi)過量的TNFα治療上述疾病的藥物有:TNFα單克隆抗體和TNFα可溶性受體,但是這些藥物存在用藥量大、需長(zhǎng)期反復(fù)使用、易引起超敏反應(yīng)的缺陷。疫苗只需少量注射就可以誘發(fā)產(chǎn)生抗體,可克服抗體及可溶性受體藥物的缺陷,因此TNFα疫苗是治療此類疾病的一條有效途徑。目的本研究的目的是篩選出一種TNFα自體疫苗分子,使之能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)出針對(duì)TNFα分子的特異性中和抗體,為TNFα表達(dá)過高的相關(guān)疾病提供一種新的治療藥物。方法構(gòu)建GST融合的小鼠TNFα(mTNFα)系列截短體,使其在大腸桿菌中獲得高效表達(dá),菌體蛋白經(jīng)SDS-PAGE后,切膠免疫小鼠,通過對(duì)誘導(dǎo)抗體滴度的分析并結(jié)合計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)確定外源T細(xì)胞輔助表位的插入位置。將編碼TT830-844(QYIKANSKFIGITEL), HEL46-61(NTDGSTDYGILQINSR)和PADRE (AKFVAAWTLKA)氨基酸的基因序列替換編碼小鼠TNFα126位至140位氨基酸序列的核酸,獲得編碼mTNF-TT,mTNF-HEL,mTNF-PADRE基因片段,將其插入pBV220原核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌,在大腸桿菌中經(jīng)表達(dá)、純化后得到mTNF-TT,mTNF-HEL,mTNF-PADRE融合蛋白,構(gòu)建出三種TNFα融合蛋白疫苗。用構(gòu)建的三種疫苗分子免疫小鼠,體外比較免疫的抗血清針對(duì)mTNFα的抗體滴度和中和活性,篩選最有效的T細(xì)胞輔助表位。用篩選得到的mTNF-PADRE治療LPS誘導(dǎo)的內(nèi)毒素休克小鼠,mTNFα誘導(dǎo)的惡病質(zhì)小鼠以及Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)小鼠,觀察治療效果。結(jié)果通過對(duì)小鼠TNFα系列截短體誘發(fā)的抗mTNFα抗血清滴度檢測(cè)和對(duì)人和小鼠TNFα抗原表位預(yù)測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠TNFα126位至140位氨基酸可以作為外源T輔助表位替換的位置。我們用外源的T輔助表位替換小鼠TNFα126-140位氨基酸,構(gòu)建了mTNF-TT,mTNF-HEL,mTNF-PADRE三種TNFα融合蛋白疫苗,經(jīng)純化純度均可達(dá)到95%以上。L929細(xì)胞的殺傷活性試驗(yàn)結(jié)果表明,mTNF-TT,mTNF-HEL,mTNF-PADRE均不具有TNFα的細(xì)胞殺傷活性。免疫小鼠結(jié)果發(fā)現(xiàn)mTNF-TT,mTNF-HEL,mTNF-PADRE均可在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)出小鼠TNFα結(jié)合性和中和性自身抗體,比較其效果,mTNF-PADRE具有最好的免疫效果。無佐劑的mTNF-PADRE免疫小鼠可以有效地延長(zhǎng)LPS誘導(dǎo)的內(nèi)毒素休克小鼠的生存期,減少mTNFα誘導(dǎo)的惡病質(zhì)小鼠的體重減輕的幅度以及減輕Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型(CIA)小鼠的癥狀。結(jié)論通過對(duì)表位插入位置和插入的表位的篩選,我們篩選的mTNF-PADRE分子可以有效地誘導(dǎo)出針對(duì)mTNFα的中和性自身抗體,并且不具有TNFα的L929細(xì)胞殺傷活性。動(dòng)物試驗(yàn)表明mTNF-PADRE在無佐劑的情況下可以有效地緩解LPS誘導(dǎo)的內(nèi)毒素休克,mTNFα誘導(dǎo)的惡病質(zhì)以及CIA小鼠的癥狀。因此其對(duì)應(yīng)的人TNF-PADRE分子可以作為TNFα自體疫苗的候選分子。
[Abstract]:Background TNFalpha is a cytokine with complex biological activity, which is mainly produced by macrophages and T cells. In addition to killing tumor cells in vivo or in vitro, TNFalpha also has many functions, such as anti-virus infection, activation of macrophages and polymorphonuclear granulocytes, promotion of histocompatibility antigen expression and regulation of immune function. However, when tumor necrosis factor is overexpressed, it produces a variety of pathological damage with other inflammatory factors, such as autoimmune diseases, infectious diseases, cachexia and so on. Therefore, neutralizing excessive TNF-a in vivo can provide an effective way for the treatment of these diseases. Drugs for these diseases include monoclonal antibodies against TNFalpha and soluble receptors for TNFalpha. However, these drugs have the disadvantages of large dosage, long-term repeated use and easy to cause hypersensitivity. OBJECTIVE To screen an autologous vaccine molecule of TNFalpha so as to induce a specific neutralizing antibody against TNFalpha molecule in vivo, and to provide a new therapeutic drug for the related diseases with high expression of TNFalpha. High expression was obtained in E. coli. After SDS-PAGE, mice were immunized by gel cutting. The insertion site of foreign T cell helper epitopes was determined by titer analysis and computer-aided design. TT830-844 (QYIKANSKFIGITEL), HEL46-61 (NTDGSTDYGILQINSR) and PADRE (AKFVAAWTLKA) amino acids were sequenced. The mTNF-TT, mTNF-HEL, mTNF-PADRE gene fragments were obtained by substituting the nucleic acids encoding murine TNF alpha 126 to 140 amino acid sequences. The fragments were inserted into the pBV220 prokaryotic expression vector and transformed into E. coli. After being expressed in E. coli, mTNF-TT, mTNF-HEL and mTNF-PADRE fusion proteins were purified. Three kinds of TNF-alpha fusion protein vaccines were constructed. Three vaccines were constructed to immunize mice. The titers and neutralizing activities of the antibodies against mTNF-alpha were compared in vitro to screen the most effective T-helper epitopes. The mTNF-PADRE was used to treat LPS-induced endotoxic shock mice, mTNF-alpha-induced cachexia mice and collagen-induced arthritis (CIA) mice. Results By detecting the titers of anti-mTNF-alpha antiserum induced by murine TNF-alpha truncated bodies and predicting the epitopes of human and murine TNF-alpha antigens, it was found that the amino acids at positions 126 to 140 of murine TNF-alpha could be used as the substitution sites for exogenous T-helper epitopes. We used exogenous T-helper epitopes to replace the amino acids at sites 126 to 140 of murine TNF-alpha. Three kinds of TNF-alpha fusion protein vaccines, mTNF-TT, mTNF-HEL and mTNF-PADRE, were constructed. The purity of these vaccines was above 95%. The cytotoxicity test of L929 cells showed that mTNF-TT, mTNF-HEL and mTNF-PADRE did not possess the cytotoxicity of TNF-alpha. Immune mice showed that mTNF-TT, mTNF-HEL and mTNF-PADRE could be induced in vivo. Mice immunized with mTNF-PADRE without adjuvant could prolong the survival time of LPS-induced endotoxic shock mice, reduce the weight loss of mTNF-alpha-induced cachexia mice and reduce the joint induced by collagen type II. Conclusion The mTNF-PADRE molecule can effectively induce neutralizing autoantibodies against mTNF-alpha and has no cytotoxic activity against TNF-alpha L929 cells. Animal experiments show that mTNF-PADRE can effectively alleviate the symptoms without adjuvant. To understand LPS-induced endotoxic shock, mTNF-alpha-induced cachexia and CIA mice symptoms, the corresponding human TNF-PADRE molecule can be used as a candidate molecule for TNF-alpha autoimmune vaccine.
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2199517