【摘要】：Smad4是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)超家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中一個(gè)共同的中介因子，在哺乳動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育過程中有重要作用。為了研究Smad4在皮膚發(fā)育中的作用，楊曉教授(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所發(fā)育和疾病遺傳學(xué)研究室)實(shí)驗(yàn)室利用Cre-loxP介導(dǎo)的重組系統(tǒng)成功建立了角質(zhì)細(xì)胞特異性Smad4基因剔除小鼠(Smad4~(co/co)；K5-Cre)。角質(zhì)細(xì)胞Smad4剔除的小鼠毛囊不能進(jìn)入退化期，出現(xiàn)進(jìn)行性脫毛。70％的Smad4~(co/co)；K5-Cre小鼠出生12個(gè)月內(nèi)發(fā)生包括皮膚腫瘤在內(nèi)的自發(fā)性腫瘤。 細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育依靠復(fù)雜的代謝和調(diào)節(jié)通路，蛋白質(zhì)則是這些通路中發(fā)揮功能的執(zhí)行體。蛋白質(zhì)組學(xué)是規(guī)模化研究蛋白質(zhì)表達(dá)組成及其調(diào)控變化的新興學(xué)科，近年來其成長(zhǎng)速度令人刮目相看。差異蛋白質(zhì)組學(xué)通過比較樣本間蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化，尋找差異分子，，用以解決各種各樣的生物學(xué)問題。目前已涌現(xiàn)出許多新穎的差異蛋白質(zhì)組分析方法，如差示熒光凝膠電泳(difference gel electrophoresis，2D DIGE)、可裂解同位素編碼親和標(biāo)簽技術(shù)(cleavable isotope-coded affinity tags，cICAT)和同位素標(biāo)簽相對(duì)和絕對(duì)定量(isobaric tags for relmive and absolute quantification，iTRAQ)等技術(shù)。由于繼承了二維凝膠電泳的高分辨率，同時(shí)又具備高重現(xiàn)性、高通量和高動(dòng)態(tài)范圍等優(yōu)勢(shì)，使得2D DIGE日益受到關(guān)注，成為最受歡迎的定量蛋白質(zhì)組研究手段之一。 為了高通量、大規(guī)模地篩選與SMAD4信號(hào)通路中有相互關(guān)系的蛋白質(zhì)，進(jìn)一步揭示脫發(fā)和皮膚腫瘤形成的分子機(jī)制，我們考察建立了2D DIGE技術(shù)并應(yīng)用該技術(shù)對(duì)角質(zhì)細(xì)胞特異性Smad4條件基因剔除小鼠的表皮進(jìn)行了差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析。文中優(yōu)化了小鼠表皮全蛋白的提取方案，考查了2D DIGE的靈敏度、重現(xiàn)性，評(píng)估了該樣本的差異域值，建立了角質(zhì)細(xì)胞特異性Smad4條件基因剔除小鼠的表皮差異蛋白質(zhì)表達(dá)譜。采用液相色譜—電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，對(duì)241個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行了鑒定，其中167個(gè)點(diǎn)得到可靠鑒定結(jié)果。對(duì)鑒定的差異蛋白進(jìn)行了詳細(xì)的生物信息學(xué)分析，這些差異表達(dá)的蛋白包括14-3-3δ、Galectin-7、FABP5、cathepsin D和Enolase 1等。對(duì)部分差異蛋白做了Western驗(yàn)證。
[Abstract]:Smad4 is a common mediator in the signal transduction pathway of transforming growth factor-beta (TGF-beta) superfamily and plays an important role in the growth and development of mammals. In order to study the role of Smad4 in skin development, Professor Yang Xiao (Laboratory of Development and Disease Genetics, Institute of Bioengineering, Academy of Military Medical Sciences) used it. Cre-loxP-mediated recombination system was successfully established in keratinocyte-specific Smad4 knockout mice (Smad4~ (co/co); K5-Cre). The hair follicles of the mice with keratinocyte-specific Smad4 knockout could not enter the degenerative stage, and progressive hair loss occurred in 70% of the Smad4~ (co/co); spontaneous tumors including skin tumors occurred in K5-Cre mice within 12 months of birth.
The growth and development of cells depend on complex metabolic and regulatory pathways, and proteins are the executors of these pathways. Proteomics is a new subject that studies the composition and regulation of protein expression on a large scale. In recent years, its growth rate is remarkable. Differential proteomics compares the protein tables between samples. Many novel differential proteomic analysis methods have emerged, such as differential gel electrophoresis (2D DIGE), cleavable isotope-coded affinity tags (cICAT). (iTRAQ) and isobaric tags for relmive and absolute quantification (isobaric tags for relmive and absolute quantification, iTRAQ) have attracted increasing attention and become the most popular quantitative proteomic research due to their inheritance of high resolution, high reproducibility, high throughput and high dynamic range of two-dimensional gel electrophoresis. One of the means.
In order to screen proteins associated with SMAD4 signaling pathway in a high throughput and large scale, and to further reveal the molecular mechanisms of hair loss and skin tumorigenesis, we investigated the establishment of a two-dimensional DIGE technique and applied it to the differential proteomic analysis of the epidermis of keratinocyte-specific Smad4 conditioned gene knockout mice. The sensitivity and reproducibility of 2D DIGE were examined, and the difference domain values of the samples were evaluated. The differential protein expression profiles of the cuticle-specific Smad4 conditioned gene knockout mice were established. 241 differentially expressed proteins were analyzed by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS). The identified differentially expressed proteins, including 14-3-3 delta, Galectin-7, FABP5, cathepsin D and Enolase 1, were analyzed in detail by bioinformatics.
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號(hào)】：R341

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本文編號(hào)：2194733