發(fā)布時(shí)間：2018-08-19 11:10

【摘要】： Alpha-黑素細(xì)胞刺激素(alpha-melanocyte stimulating hormone,α-MSH)作為神經(jīng)肽和神經(jīng)內(nèi)分泌激素在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用,為一有效的抗炎和免疫調(diào)節(jié)分子。α-MSH的受體有五種,命名為MC1~5R,都與G蛋白耦聯(lián),屬于I型與G蛋白耦聯(lián)受體家族,具有七次跨膜結(jié)構(gòu),MC1R、MC3R、MC5R參與免疫調(diào)節(jié)。MCRs具有高度同源性(42%-67%),為目前已知的最小的G蛋白耦聯(lián)受體,功能性的耦聯(lián)腺苷酸環(huán)化酶(AC)。α-MSH結(jié)合MCR后,激活G蛋白活化亞基Gs,Gs活化AC,AC催化ATP轉(zhuǎn)化為cAMP,胞漿cAMP的升高激活蛋白激酶A(PKA),PKA可以通過磷酸化作用影響胞內(nèi)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)并發(fā)揮一系列的生物學(xué)效應(yīng)。大量文獻(xiàn)報(bào)道,胞漿cAMP水平的升高可抑制TCR介導(dǎo)的T細(xì)胞活化,因此cAMP發(fā)揮著重要的免疫調(diào)節(jié)功能。 在T細(xì)胞活化過程中,T細(xì)胞與抗原提呈細(xì)胞(APC)的相互作用需要細(xì)胞表面分子的相互結(jié)合(TCR/CD3-MHC/Ag、CD28-CD80、LFA-1-ICAM-1等)以形成穩(wěn)定、緊密的相互接觸結(jié)構(gòu)——免疫突觸(immunological synapse, IS),并持續(xù)傳遞活化信號(hào),有效免疫突觸的形成是觸發(fā)TCR信號(hào)的關(guān)鍵。 脂筏為富含膽固醇和鞘磷脂的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)微域,其主要功能是募集信號(hào)蛋白分子并提供信號(hào)分子在質(zhì)膜發(fā)生相互作用的平臺(tái),富集一些有利于TCR信號(hào)發(fā)生的分子(TCR、CD3、LAT、ZAP-70、Lck等)的同時(shí)將一些分子排除于脂筏區(qū)域之外(比如CD45),以利于免疫突觸的形成。在靜息T淋巴細(xì)胞,脂筏均勻地分布于細(xì)胞膜。T細(xì)胞接受抗原刺激或表面分子被交聯(lián)后,脂筏發(fā)生聚集,并負(fù)責(zé)募集與信號(hào)發(fā)生有關(guān)的信號(hào)蛋白到激發(fā)部位(尤其是在免疫突觸形成過程中),觸發(fā)有效的TCR信號(hào)并向胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)活化信號(hào)。 在脂筏聚集和免疫突觸形成過程中,膜上分子的移動(dòng)依賴于細(xì)胞膜內(nèi)胞漿細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白微絲的重排,從而有利于免疫突觸的有效形成以及信號(hào)分子最大限度的接觸和結(jié)合,進(jìn)而產(chǎn)生有效的活化信號(hào)。 由于已經(jīng)明確α-MSH具有明顯的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用,以及本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果表明人外周血T淋巴細(xì)胞表達(dá)五型MCRs(MC1R～MC5R),α-MSH可以抑制絲裂原PHA刺激T淋巴細(xì)胞的引起的增殖,抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-AT的DNA結(jié)合活性,從而抑制IL-2的合成。鑒于以上的α-MSH的作用以及有關(guān)T細(xì)胞活化過程中脂筏、免疫突觸這兩個(gè)模型的最新研究進(jìn)展,同時(shí)由于在免疫應(yīng)答過程中,淋巴細(xì)胞的活化與否、活化的強(qiáng)度如何、尤其是T細(xì)胞的活化在適應(yīng)性免疫應(yīng)答產(chǎn)生過程中的關(guān)鍵作用,以及α-MSH尚未闡明的免疫調(diào)節(jié)功能的確切分子機(jī)制,因此本研究從特異性T細(xì)胞活化的關(guān)鍵啟動(dòng)步驟——脂筏聚集和免疫突觸形成入手,通過研究α-MSH對(duì)T細(xì)胞脂筏的運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞骨架蛋白的重排、相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的表達(dá)、細(xì)胞因子的分泌的影響,探討α-MSH調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化的機(jī)制,為進(jìn)一步闡明神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)機(jī)制,以及研究α-MSH用于防治免疫應(yīng)答介導(dǎo)的炎癥性疾病,提供新的理論依據(jù),也為篩選或設(shè)計(jì)抗炎和免疫抑制藥物提供新的作用靶標(biāo)。 第一部分α-MSH對(duì)T淋巴細(xì)胞活化后表面分子表達(dá)以及細(xì)胞因子分泌的調(diào)節(jié)作用 利用白血病T淋巴瘤Jurkat細(xì)胞株作為研究對(duì)象;采用ELISA方法對(duì)不同刺激因素活化的T淋巴細(xì)胞和/或α-MSH(10-7mol/L)處理的細(xì)胞培養(yǎng)物離心后的上清進(jìn)行細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、TNF-α、IFN-γ?測(cè)定;FACS分析T淋巴細(xì)胞表面分子CD3、LFA-1、CD45、活化標(biāo)志CD69等表達(dá)的變化。利用Ca~(2+)離子探針Fluo-3-AM檢測(cè)T淋巴細(xì)胞游離Ca~(2+)的變化,Fluo-3-AM(5μM)與T淋巴細(xì)胞共孵育后,FACS連續(xù)分析在不同刺激因素(CD3/CD28 mAb 1μg/ml,PMA 50ng/ml,α-MSH 10-7mol/L)下胞內(nèi)Ca~(2+)離子濃度的變化以及α-MSH對(duì)該變化的影響。利用Western Blotting技術(shù)對(duì)T淋巴細(xì)胞活化過程中的p38 MAPK和NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)行分析。 對(duì)于Th1類細(xì)胞因子的研究發(fā)現(xiàn),PMA可以引起IL-2、IFN-γ、TNF-α分泌的顯著升高(P0.05);PMA活化的T淋巴細(xì)胞的同時(shí)給予α-MSH處理,結(jié)果顯示T淋巴細(xì)胞所分泌的IL-2、IFN-γ、TNF-α與PMA單獨(dú)刺激作用相比有顯著的降低(P0.01)。采用100 ng/ml濃度的SEB對(duì)Jurkat細(xì)胞進(jìn)行刺激,同時(shí)給予α-MSH(10~(-7)mol/L)并作用12 h后,取上清進(jìn)行細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α測(cè)定。結(jié)果顯示,SEB刺激的T淋巴細(xì)胞所分泌細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α有顯著的提高(P0.05);α-MSH對(duì)SEB活化的T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α有顯著的抑制作用(P0.05)。CD3/CD28 mAb刺激Jurkat T淋巴細(xì)胞后,IL-2和IFN-γ的分泌有非常顯著的升高(P0.01);α-MSH與CD3/CD28 mAb聯(lián)合作用的Jurkat T淋巴細(xì)胞,IL-2和IFN-γ的分泌有明顯的下降(P0.05)。 對(duì)于Th2類細(xì)胞因子的研究發(fā)現(xiàn),CD3/CD28 mAb活化的Jurkat T淋巴細(xì)胞, IL-4的分泌水平明顯低于對(duì)照組;α-MSH聯(lián)合CD3/CD28 mAb作用的Jurkat T淋巴細(xì)胞IL-4的分泌顯著高于CD3/CD28 mAb的單獨(dú)作用(P0.05)。細(xì)胞因子IL-5的分泌與未活化的Jurkat T細(xì)胞相比,未發(fā)現(xiàn)有明顯的變化。α-MSH聯(lián)合CD3/CD28 mAb作用的Jurkat T淋巴細(xì)胞IL-5的分泌顯著高于CD3/CD28 mAb的單獨(dú)作用(P0.05)。細(xì)胞因子IL-10的分泌與未活化的對(duì)照組相比略有升高。α-MSH聯(lián)合CD3/CD28 mAb作用的Jurkat T淋巴細(xì)胞IL-10的分泌非常顯著地低于CD3/CD28 mAb的單獨(dú)作用(P0.01)。 PMA活化的Jurkat T細(xì)胞分泌IL-4的水平與未活化的對(duì)照組相比未發(fā)現(xiàn)有明顯的變化;α-MSH聯(lián)合PMA作用于Jurkat T細(xì)胞,與PMA單獨(dú)作用組相比,IL-4的分泌有顯著的升高(P0.05)。PMA活化的T細(xì)胞分泌IL-5水平有明顯的降低;α-MSH與PMA的聯(lián)合作用于Jurkat T細(xì)胞,IL-5的分泌顯著高于PMA的單獨(dú)作用(P0.05)。PMA活化的Jurkat T細(xì)胞分泌的IL-10非常顯著地高于未活化的Jurkat T細(xì)胞。α-MSH與PMA的聯(lián)合作用于Jurkat T細(xì)胞,IL-10的分泌非常明顯的低于PMA的單獨(dú)作用(P0.01)。 FACS分析發(fā)現(xiàn),α-MSH可以下調(diào)Jurkat T細(xì)胞活化后SLP-76、CD3、LFA-1的表達(dá),可以延緩T淋巴細(xì)胞活化標(biāo)志CD69分子在PMA和CD3/CD28 mAb刺激下的表達(dá)。CD3/CD28 mAb活化的Jurkat T細(xì)胞在18h內(nèi)表達(dá)CD45分子有所上升。同時(shí)經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn),α-MSH與CD3/CD28 mAb聯(lián)合作用Jurkat T細(xì)胞,CD45分子的表達(dá)明顯高于CD3/CD28 mAb的單獨(dú)作用。 CD3/CD28 mAb刺激Jurkat T細(xì)胞活化后,FACS分析發(fā)現(xiàn),0~22h內(nèi),CD69分子的表達(dá)持續(xù)上升。α-MSH對(duì)CD3/CD28 mAb所活化的Jurkat T細(xì)胞表達(dá)CD69分子在2~22h有明顯的抑制作用(P0.05),說明α-MSH對(duì)CD3/CD28mAb所引起的T細(xì)胞活化有抑制作用。PMA活化Jurkat T細(xì)胞后,CD69分子的表達(dá)持續(xù)上升,其中2~8h內(nèi)上升幅度最快,于8h左右達(dá)到高峰,之后的8~32h內(nèi)CD69分子一直維持在高表達(dá)水平。在7h未發(fā)現(xiàn)α-MSH對(duì)PMA引起的T細(xì)胞活化后CD69分子的表達(dá)存在抑制作用;在1~7h內(nèi)發(fā)現(xiàn)α-MSH與PMA聯(lián)合作用于T細(xì)胞,CD69分子表達(dá)水平高于PMA的單獨(dú)作用,這與α-MSH對(duì)CD3/CD28 mAb刺激T細(xì)胞表達(dá)CD69分子的抑制現(xiàn)象正好相反,說明存在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的不同機(jī)制。PHA刺激的Jurkat T細(xì)胞,在1、2、3h未發(fā)現(xiàn)CD69分子的表達(dá)有明顯的變化,在7h有顯著的上升,α-MSH對(duì)這種上調(diào)作用有明顯的抑制作用。 T細(xì)胞受CD3/CD28 mAb刺激后,胞內(nèi)Ca~(2+)迅速上升,130 sec左右達(dá)到高峰,隨后逐漸下降,300 sec后接近于正常水平。α-MSH與CD3/CD28 mAb聯(lián)合作用于T細(xì)胞,胞漿游離Ca~(2+)水平顯著高于正常水平,持續(xù)維持一定濃度,并低于CD3/CD28 mAb的單獨(dú)作用,沒有峰值的出現(xiàn)。說明α-MSH能夠抑制CD3/CD28 mAb所引起的T細(xì)胞胞漿游離Ca~(2+)的升高。 PMA的結(jié)構(gòu)類似于DG,作用于T細(xì)胞后,可以模擬T細(xì)胞活化后引起的DG產(chǎn)生,從而引起胞漿游離Ca~(2+)迅速上升。本研究觀察到,PMA作用于T細(xì)胞后,在幾秒鐘內(nèi),胞漿游離Ca~(2+)迅速上升,并且隨著時(shí)間的延長,一直維持較高水平,在本研究所觀察的300 sec內(nèi),未發(fā)現(xiàn)有明顯下降的趨勢(shì)。α-MSH聯(lián)合PMA作用于T細(xì)胞,胞漿游離Ca~(2+)數(shù)秒內(nèi)迅速升高,隨后緩慢下降,50 sec后,胞漿游離Ca~(2+)水平開始低于PMA單獨(dú)的作用,一直延續(xù)到本研究所觀察到的300s還有緩慢下降的趨勢(shì),說明α-MSH能夠抑制PMA所引起的T細(xì)胞胞漿游離Ca~(2+)水平的升高。 West Blotting分析發(fā)現(xiàn),活化后的T細(xì)胞,在α-MSH作用下,胞漿NF-κB、p38MAPK的水平有所下降。 第二部分α-MSH對(duì)T淋巴細(xì)胞活化后細(xì)胞膜脂筏含量以及脂筏募集信號(hào)分子的調(diào)節(jié)作用 采用蔗糖密度梯度低溫超速離心技術(shù)對(duì)T淋巴細(xì)胞脂筏進(jìn)行分離并對(duì)不同密度的脂筏進(jìn)行收集;利用三氯醋酸(TCA)蛋白沉淀方法對(duì)不同密度的脂筏內(nèi)蛋白進(jìn)行沉淀和純化;利用Brad-Ford蛋白定量方法對(duì)不同脂筏組分蛋白進(jìn)行定量分析;SDS-PAGE技術(shù)對(duì)脂筏內(nèi)蛋白進(jìn)行定性和半定量分析;利用FACS技術(shù)結(jié)合β-環(huán)糊精可去除脂筏內(nèi)膽固醇成分的原理對(duì)脂筏內(nèi)信號(hào)蛋白分子進(jìn)行定量分析;利用脂筏特異性標(biāo)志物GM1的熒光標(biāo)記配體——霍亂腸毒素亞單位B(CT-B)作為示蹤劑,在激光共聚焦顯微鏡下對(duì)脂筏的分布及聚集情況進(jìn)行觀察;采用熒光實(shí)時(shí)(Real-time)定量PCR技術(shù)對(duì)脂筏主要成分GM3分子合成酶的基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行定量分析。 通過對(duì)脂筏分析的結(jié)果發(fā)現(xiàn),α-MSH抑制脂筏內(nèi)總蛋白的含量,抑制LAT、ZAP-70、Lck、Talin蛋白在脂筏內(nèi)的分布和含量,降低了CD3、CD28分子在脂筏內(nèi)的分布,減少了脂筏主要成分GM3、GM1的合成。α-MSH與CD3/CD28 mAb聯(lián)合作用于Jurkat T淋巴細(xì)胞,可使脂筏的聚集程度明顯下降。 第三部分α-MSH對(duì)T淋巴細(xì)胞活化過程中與APC之間形成免疫突觸的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制 采用白血病B淋巴瘤Raji細(xì)胞株作為抗原提呈細(xì)胞(APC),以超抗原葡萄球菌腸毒素B(SEB)進(jìn)行抗原負(fù)載,然后與T淋巴細(xì)胞進(jìn)行結(jié)合以形成IS并作為研究對(duì)象;在α-MSH處理因素下,利用熒光標(biāo)記的細(xì)胞膜表面特定抗原的抗體和細(xì)胞熒光示蹤染料標(biāo)記細(xì)胞,在激光共聚焦顯微鏡下觀察免疫突觸的形成以及數(shù)目、脂筏和不同分子的分布情況等。利用FACS技術(shù)分析T淋巴細(xì)胞活化及免疫突觸的形成以及該過程中細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白微絲的聚集情況;分析細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白(ERM、Vav、EBP50、Talin、CDC42等)表達(dá)的變化以及磷酸化和去磷酸化程度。 通過激光共聚焦顯微鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)α-MSH降低了免疫突觸的形成數(shù)目,抑制了脂筏的聚集,降低了CD3分子的帽化程度,抑制了T細(xì)胞細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白微絲在細(xì)胞活化后的聚集程度。經(jīng)隨機(jī)視野對(duì)CD3帽化數(shù)目計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn),PMA活化24h后的Jurkat T細(xì)胞與APCs之間形成IS時(shí),CD3分子帽化比率明顯高于正常非處理對(duì)照組(P0.01, n=4)。同時(shí)經(jīng)α-MSH和PMA作用過的Jurkat T細(xì)胞與APCs之間形成IS時(shí),CD3帽化數(shù)目明顯降低(P0.05, n=4)。 FACS分析發(fā)現(xiàn),未經(jīng)處理的Jurkat T細(xì)胞與Raji B細(xì)胞之間形成IS的細(xì)胞數(shù),在混合細(xì)胞中所占比率為5.16%;CD3/CD28 mAb活化24h后的Jurkat T細(xì)胞與Raji B細(xì)胞之間所形成IS的細(xì)胞數(shù),占所有細(xì)胞的比率為18.02%;活化抗體聯(lián)合α-MSH作用的Jurkat T細(xì)胞與Raji B細(xì)胞之間所形成IS的細(xì)胞數(shù),占所有細(xì)胞比率的12.30%,說明α-MSH可以抑制活化的T細(xì)胞與APCs之間形成IS的能力。 T細(xì)胞活化后,可引起細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白的聚集,從而引起T細(xì)胞功能和形態(tài)的變化。微絲肌動(dòng)蛋白染色后,聚集的微絲肌動(dòng)蛋白的熒光強(qiáng)度明顯升高。FACS分析發(fā)現(xiàn),CD3/CD28 mAb活化的Jurkat T細(xì)胞在10 min時(shí)檢測(cè)到最大的熒光強(qiáng)度,而用α-MSH作用20 min后,開始對(duì)F-actin的聚集程度有所抑制,到40 min時(shí)基本恢復(fù)到靜息狀態(tài)水平。此研究結(jié)果提示,α-MSH可以抑制由CD3/CD28 mAb所引起的T細(xì)胞細(xì)胞骨架微絲肌動(dòng)蛋白的極化。 Talin是一種重要的細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白,一端與細(xì)胞膜整合素結(jié)合,一端與肌動(dòng)蛋白結(jié)合。外界配體結(jié)合胞膜整合素受體后,可以引起Talin的構(gòu)型變化。Talin可以與PIP2生成酶PIPKIγ-90(phosphatedylino- sitol phosphate kinase type Iγ-90)的剪接變體結(jié)合并使它激活,因此Talin可以刺激PIP2的生成,PIP2的生成反過來又可以增強(qiáng)Talin與整合素蛋白的相互作用,從而傳遞信號(hào)到細(xì)胞內(nèi)部,引起細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白的聚集。本研究發(fā)現(xiàn)CD3/CD28 mAb活化的Jurkat T細(xì)胞在2h開始Talin表達(dá)升高;同時(shí)α-MSH與CD3/CD28 mAb聯(lián)合作用于Jurkat T細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)Talin的表達(dá)有所下降,說明α-MSH在TCR活化信號(hào)途徑中,有下調(diào)Talin蛋白表達(dá)的作用。鑒于Talin在整合素(比如LFA-1等)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要作用,因此推論,α-MSH可以通過抑制Talin蛋白的表達(dá)而影響T細(xì)胞活化過程中由整合素所傳遞的信號(hào)。PMA活化的Jurkat T細(xì)胞表達(dá)Talin蛋白未發(fā)現(xiàn)有變化,而α-MSH與PMA聯(lián)合作用于Jurkat T細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)Talin蛋白的表達(dá)有所升高。由于PMA所活化的T細(xì)胞不涉及整合素家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,因此Talin蛋白在PMA活化的T細(xì)胞信號(hào)通路中的作用機(jī)制尚不明確。 細(xì)胞形態(tài)的維持,以及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與表面張力的形成依賴于與細(xì)胞膜交聯(lián)的胞漿細(xì)胞骨架,而聯(lián)系細(xì)胞膜(包括脂筏)與細(xì)胞骨架的接頭蛋白為埃茲蛋白、根蛋白和膜突蛋白(ezrin-radixin-moesin, ERM)蛋白家族系統(tǒng)。該家族蛋白以自身首尾折疊的形式處于非活化封閉構(gòu)象狀態(tài),ezrin的氨基端FERM結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合細(xì)胞膜上的CD43、CD44、ICAMs-1/2/3、PSGL-1,而羧基端可以與肌動(dòng)蛋白結(jié)合。ERM蛋白在細(xì)胞骨架運(yùn)動(dòng)過程中發(fā)揮重要的作用,T淋巴細(xì)胞通過TCR接受外來刺激信號(hào)后,引起ERM蛋白的磷酸化。識(shí)別抗原后,T淋巴細(xì)胞內(nèi)ERM蛋白通過Vav1-Rac1途徑去磷酸化而失活。同時(shí)也證實(shí),ERM蛋白的去磷酸化有利于細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白從細(xì)胞膜的錨著部位脫離,提高了膜的柔韌性,從而有利于T-APC之間免疫突觸的形成。研究發(fā)現(xiàn),CD3/CD28 mAb活化Jurkat T細(xì)胞后,未發(fā)現(xiàn)ERM蛋白表達(dá)的變化,也未發(fā)現(xiàn)α-MSH對(duì)ERM蛋白表達(dá)有明顯的影響。PMA活化的Jurkat T細(xì)胞在10h時(shí)ERM蛋白的表達(dá)有一定升高,α-MSH對(duì)這種上調(diào)有一定的抑制作用。通過對(duì)ERM蛋白磷酸化水平的分析發(fā)現(xiàn),在1h時(shí),α-MSH與CD3/CD28 mAb聯(lián)合作用的ERM蛋白的磷酸化水平高于CD3/CD28 mAb的單獨(dú)作用。 EBP50(ERM binding phosphoprotein 50)為連接脂筏和細(xì)胞骨架的接頭蛋白,通過其PDZ結(jié)構(gòu)域與Cbp(Csk binding protein)結(jié)合,其C末端與ERM蛋白結(jié)合,從而將Cbp與ERM蛋白連接起來,調(diào)控肌動(dòng)蛋白對(duì)脂筏的聚集作用。T細(xì)胞活化后,Cbp/PAG(Csk相關(guān)的膜接頭蛋白)被募集于脂筏內(nèi), Cbp的高表達(dá)可以降低膜的柔韌性,從而抑制IS的形成,EBP50突變體可以恢復(fù)IS的形成以及T細(xì)胞的活化。說明EBP50在膜的運(yùn)動(dòng)性以及T細(xì)胞活化、IS形成中發(fā)揮重要的負(fù)性調(diào)控作用。本研究發(fā)現(xiàn)CD3/CD28 mAb活化Jurkat T細(xì)胞后12h內(nèi),未發(fā)現(xiàn)EBP50表達(dá)的變化,而α-MSH聯(lián)合CD3/CD28 mAb作用于Jurkat T細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)EBP50的表達(dá)的下降。PMA活化的Jurkat T細(xì)胞,在10h時(shí)發(fā)現(xiàn)EBP50有所下降;α-MSH和PMA的聯(lián)合作用,在1h時(shí)發(fā)現(xiàn)EBP50水平高于PMA的單獨(dú)作用。 Cdc42為Rho家族的小分子鳥苷酸三磷酸酶成員,通過構(gòu)象改變來實(shí)現(xiàn)活化(GTP結(jié)合)和去活化(GDP結(jié)合)狀態(tài),這種轉(zhuǎn)換是受鳥苷酸轉(zhuǎn)換因子GEFs(如Vav)等的調(diào)節(jié)。Vav1活化的Cdc42與WASP蛋白結(jié)合,使WASP移位于細(xì)胞膜附近并打開其活化的開放結(jié)構(gòu),活化的WASP與Arp3/2發(fā)生作用,進(jìn)而引起肌動(dòng)蛋白的多聚化。本研究發(fā)現(xiàn)CD3/CD28 mAb活化的Jurkat T細(xì)胞在10~12h時(shí)Cdc42表達(dá)升高,而α-MSH與CD3/CD28 mAb的聯(lián)合作用發(fā)現(xiàn)Cdc42表達(dá)水平降低。PMA或CD3/CD28 mAb活化的T細(xì)胞12h內(nèi)未見Vav蛋白表達(dá)的變化;而α-MSH與PMA或CD3/CD28 mAb的聯(lián)合作用2h后發(fā)現(xiàn),Vav蛋白水平低于PMA或CD3/CD28 mAb的單獨(dú)作用下的Vav水平。通過對(duì)Vav蛋白磷酸化水平的分析發(fā)現(xiàn),在60min內(nèi),α-MSH與PMA或CD3/CD28 mAb的聯(lián)合作用Vav蛋白的磷酸化水平明顯低于PMA或CD3/CD28 mAb的單獨(dú)作用。 結(jié)論 α-MSH可以抑制T淋巴細(xì)胞分泌Th1細(xì)胞因子IL-2、TNF-α和IFN-γ,促進(jìn)T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生Th2細(xì)胞因子IL-4、IL-5。α-MSH降低了T細(xì)胞活化后CD69、CD28、LFA-1、SLP-76等的表達(dá),降低了胞漿游離Ca2+的濃度以及NF-κB和p38MAPK的水平。α-MSH能降低活化的T淋巴細(xì)胞與APCs形成IS的能力,降低活化后細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白微絲的聚集程度。α-MSH可以改變T淋巴細(xì)胞活化過程中脂筏的合成和聚集,降低了信號(hào)分子或接頭蛋白(Lck、LAT、CD3、CD28、ZAP-70)在脂筏內(nèi)的含量,從而阻礙TCR信號(hào)發(fā)生平臺(tái)的產(chǎn)生,進(jìn)而抑制T淋巴細(xì)胞的活化。 本課題組前期研究結(jié)果證實(shí)了α-MSH可以對(duì)由Th1反應(yīng)所引起的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)產(chǎn)生保護(hù)作用、對(duì)小鼠心臟移植排斥反應(yīng)具有抑制作用,可以延長移植物的存活時(shí)間。本課題從分子水平部分闡明了α-MSH抑制T細(xì)胞活化的機(jī)制,進(jìn)而豐富了α-MSH的抗炎作用機(jī)制,也為α-MSH的擬肽藥物應(yīng)用于治療免疫應(yīng)答介導(dǎo)的炎癥疾病提供了理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R392

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2191486