【摘要】： X染色體連鎖的淋巴增生綜合癥是一種免疫缺陷的遺傳性疾病。XLP的患者在受EB病毒感染后,出現(xiàn)致死的爆發(fā)性單核細胞增生。有些患者出現(xiàn)漸進性的丙種球蛋白異常和嚴重的淋巴細胞增生異常,如惡性淋巴癌。有些情況下,患者也會出現(xiàn)自身免疫疾病,如脈管炎,腸炎或再生障礙性貧血。甚至在沒有EB病毒的感染下,患者也會出現(xiàn)類似的異常。XLP患者的多種缺陷表明X染色體連鎖的淋巴增生綜合癥是一種根本性的免疫缺陷疾病。 在1998年,同時有三個實驗室發(fā)現(xiàn),SAP/SH2D1A/DSHP這個基因的異常引起了XLP疾病。SAP基因在自然殺傷細胞(NK)和T細胞中表達。人的SAP蛋白是一個由128個氨基酸組成的小分子蛋白,其中氨基端的6-102個氨基酸組成了一個SH2功能域,而羧基端的26個氨基酸與任何已知的功能域都沒有同源性。許多的研究表明,SAP能與SLAM家族的受體結合,包括SLAM, 2B4(CD244),CD84, Ly9(CD229), NTB-A(Ly108)和CRACC。SAP通過其SH2功能域與這些受體胞質部分的TxYxxV/I模塊結合。因此,這些受體可能通過招募SAP傳導下游信號。而在X染色體連鎖的淋巴增生綜合癥患者中缺乏行使正常功能的SAP蛋白,由此人們推斷,XLP患者表現(xiàn)出的免疫缺陷癥狀可能是由于一個或多個SLAM家族受體的信號無法通過SAP傳遞,最終導致了免疫反應的嚴重異常。 在XLP患者中,有多種免疫細胞出現(xiàn)功能異常,包括CD4陽性T細胞, CD8陽性T細胞, NK細胞和B細胞。此外,SAP敲除小鼠的免疫缺陷也表明了SAP在免疫調節(jié)中起關鍵作用。這些小鼠極易受嚙齒類淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒和伽瑪皰疹病毒-68的感染,其CD8陽性T細胞的抗病毒反應也存在異常。從SAP敲除小鼠中分離到的CD4陽性T細胞在CD3抗體刺激下,無法正常分泌白細胞介素-(4IL-4),說明其T細胞表面抗原受體(TCR)介導的信號通路也存在異常。 許多實驗室對SAP在T細胞和NK細胞中的信號傳導機制進行了研究。已有報道證明,SAP的SH2功能域能與Src家族激酶Fyn的SH3功能域結合,將Fyn招募到SLAM家族受體上,并由此介導SLAM受體下游的信號通路,最終導致T細胞活化。然而SLAM缺陷小鼠和Fyn缺陷小鼠表現(xiàn)出的免疫缺陷癥狀不完全相同,提示除Fyn之外,還可能有其它的信號分子參與了SLAM-SAP的信號通路。XLP患者表現(xiàn)出的多種癥狀也支持了這種提示。 通過酵母雙雜交篩選系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)PIX家族成員與SAP結合。PIX家族是一類小分子鳥苷酸酶Rac/Cdc42的鳥苷轉換因子,目前發(fā)現(xiàn)有兩個成員,αPIX和βPIX。PIX蛋白由N端的SH3功能域, DH功能域, PH功能域和C端的一個卷曲螺旋功能域組成。PIX通過SH3功能域與PAK中的脯氨酸富集區(qū)結合。 通過一系列的免疫共沉淀實驗,我們證明了在T細胞中,SAP與PIX有直接的相互作用,SAP介導了PIX被招募到SLAM家族受體上,傳導SLAM受體下游的信號。而與SAP類似的另一個僅含SH2功能域的蛋白EAT-2,卻并不能與PIX結合,也不能將PIX招募到SLAM家族受體上。通過SAP中關鍵點氨基酸突變,我們發(fā)現(xiàn)PIX和SAP的結合是通過SAP-SH2功能域中的第二個界面,所以不影響SAP與SLAM的結合。 通過構建截斷體和關鍵點氨基酸突變,我們發(fā)現(xiàn),PIX的SH3功能域對于SAP的結合是充分而且必要的。在哺乳動物細胞中,SAP與PAK競爭結合PIX。此外,SAP與PIX,活化狀態(tài)的Cdc42形成了復合體,提示SAP與PIX可能將SLAM家族受體的信號通路與Cdc42介導的下游信號通路相連。 為了揭示PIX與SAP在相關信號傳導過程中的作用,我們利用已有的報告基因系統(tǒng)檢測了SAP在NFkB,NFAT,AP-1及p53信號通路中的作用。SAP的過量表達在NFkB,AP-1及p53的信號通路中沒有明顯的作用。而在T細胞中表達SAP能顯著激活PMA和離子酶素誘導的NFAT(活化T細胞核因子)活性。SAP的這個效果是通過與鈣離子信號協(xié)同作用實現(xiàn)的。目前為止,只有活化形式的Ras有如此強的激活作用,提示SAP可能在T細胞活化中有特殊作用。而SAP的同源類似物EAT-2對NFAT的激活沒有作用。此外,SAP的關鍵點氨基酸突變體SAP-R32Q和SAP-R78A都沒有這個效果,證明SLAM受體和SAP下游的信號對于SAP的激活作用是必需的。失活狀態(tài)的Ras完全地阻斷了SAP對NFAT的激活,提示Ras的信號通路對SAP激活NFAT是必需的,SAP可能通過直接參與Ras信號通路起作用,也可能通過其它的信號通路影響Ras的信號傳導起作用。 為了驗證SAP-PIX的結合對SAP在NFAT的激活作用中是有意義的,我們構建了功能性阻斷體PIX-SH3功能域。通過NFAT報告基因檢測,發(fā)現(xiàn)PIX-SH3功能域的表達完全抑制了SAP對NFAT的激活效果,而表達不能與SAP結合的PIX-SH3-W43P/W44G功能域并不影響SAP對NFAT信號的激活,說明SAP-PIX的結合在T細胞的活化中可能有特殊作用。此外,Fyn-SH3功能域的表達也不影響SAP對NFAT信號的激活,說明在T細胞中信號通路中,PIX可能是與SAP結合的另一個主要目標。 在此,我們的研究揭示了X染色體連鎖的淋巴增生綜合癥基因產物SAP與Rac/Cdc42的鳥苷轉換因子PIX存在相互作用并參與T細胞信號通路,能幫助闡述X染色體連鎖的淋巴增生綜合癥的病因學,為研究XLP的治療方法打下基礎。
[Abstract]:X chromosome linked lymphoproliferative syndrome is a kind of immune deficient hereditary disease.XLP that causes fatal mononuclear cell proliferation after EB virus infection. Some patients appear progressive gamma globulin and severe lymphocytic dysplasia, such as malignant lymphoid cancer. In some cases, patients will also come out. Autoimmune diseases, such as vasculitis, enteritis, or aplastic anemia. Even without EB virus infection, patients also have a variety of defects in patients with similar abnormal.XLP indicating that X chromosome linked lymphoproliferative syndrome is a fundamental immunodeficiency disease.
In 1998, three laboratories found that the abnormality of the SAP/SH2D1A/DSHP gene caused the XLP disease.SAP gene to be expressed in natural killer cells (NK) and T cells. The human SAP protein is a small molecular protein composed of 128 amino acids, of which 6-102 amino acids in the amino terminal form a SH2 functional domain and 26 of the carboxyl end. The amino acids are not homologous with any known functional domain. Many studies have shown that SAP can bind to the receptors of the SLAM family, including SLAM, 2B4 (CD244), CD84, Ly9 (CD229), NTB-A (Ly108), and CRACC.SAP by its SH2 functional domain, which are combined with the cytoplasmic parts of these receptors. Downstream signals, and the lack of normal function SAP protein in patients with X chromosome linked lymphoproliferative syndrome, it is inferred that the immune deficiency symptoms in XLP patients may be due to the inability of one or more SLAM family receptors to pass through SAP, and ultimately lead to a severe immune response.
In XLP patients, many immune cells have abnormal function, including CD4 positive T cells, CD8 positive T cells, NK cells and B cells. In addition, the immunodeficiency of SAP knockout mice also indicates that SAP plays a key role in immune regulation. These mice are highly susceptible to the sense of rodent lymphocytic choroidal meningitis virus and gamma herpes virus -68. The antiviral response of the CD8 positive T cells is also abnormal. The CD4 positive T cells isolated from the SAP knockout mice can not normally secrete the interleukin (4IL-4) under the stimulation of CD3 antibody, indicating that the signal pathway mediated by the T cell surface antigen receptor (TCR) is also abnormal.
Many laboratories have studied the signal transduction mechanism of SAP in T and NK cells. It has been reported that the SH2 functional domain of SAP can be combined with the SH3 functional domain of the Src family kinase Fyn and recruits Fyn to the SLAM family receptor, and thus mediates the signal pathway downstream of SLAM receptor and ultimately leads to the activation of the T cells. The immune deficiency symptoms in YN deficient mice are not exactly the same, suggesting that other signal molecules may be involved in the signal pathway of the SLAM-SAP in addition to Fyn, and a variety of symptoms also support the hint.
The yeast two hybrid screening system found that PIX family members and SAP.PIX family are a guanosine conversion factor of a class of small molecular guanosine enzyme Rac/Cdc42, and there are two members. The alpha and beta PIX.PIX proteins are composed of SH3 functional domains of N end, DH functional domain, PH functional domain and C end. The domain is combined with the proline enrichment area in PAK.
Through a series of immunoprecipitation experiments, we have shown that SAP and PIX have direct interaction in T cells. SAP mediates PIX being recruited to the SLAM family receptor and conducting the downstream signal of the SLAM receptor. While another protein EAT-2, similar to SAP, only contains SH2 functional domains, can not be combined with PIX and can not recruit PIX to the family. By mutation of the key point amino acid in SAP, we found that the combination of PIX and SAP is through the second interfaces in the SAP-SH2 functional domain, so it does not affect the binding of SAP to SLAM.
By constructing the truncate and key point amino acid mutations, we found that the SH3 functional domain of PIX is sufficient and necessary for the binding of SAP. In mammalian cells, SAP and PAK are competing with PIX. in addition to SAP and PIX, and Cdc42 in the activation state forms a complex, suggesting that SAP and PIX may mediate the signaling pathway of the SLAM family receptor. The downstream signal paths are connected.
In order to reveal the role of PIX and SAP in the related signal transduction, we have detected the effect of SAP in the signaling pathways of NFkB, NFAT, AP-1, and p53 in the signaling pathway of NFkB, NFAT, AP-1 and p53, and we have detected no significant effect in the NFkB, AP-1 and p53 signaling pathways. The effect of NFAT (activated T nuclear factor) active.SAP is achieved by synergistic action with the calcium ion signal. So far, only the active form of Ras has such strong activation, suggesting that SAP may have a special role in the activation of T cells. And the SAP homologous analogue EAT-2 has no effect on the activation of NFAT. In addition, SAP is closed. The key point amino acid mutants SAP-R32Q and SAP-R78A do not have this effect, proving that the signal of the SLAM receptor and the downstream of the SAP is necessary for the activation of SAP. The Ras in the inactivation state completely blocks the activation of the SAP to NFAT, suggesting that the Ras signaling pathway is necessary for SAP activation NFAT, and SAP may play a role by directly participating in the signaling pathway. It may also affect the signal transduction of Ras through other signaling pathways.
In order to verify the significance of the combination of SAP-PIX in the activation of SAP in NFAT, we constructed the functional domain of the functional blockage PIX-SH3. Through NFAT reporter gene detection, it was found that the expression of the PIX-SH3 functional domain completely inhibited the activation effect of SAP on NFAT, and the PIX-SH3-W43P/W44G functional domain, which was not associated with SAP, did not affect SAP. The activation of the NFAT signal indicates that the binding of SAP-PIX may have special effects on the activation of T cells. In addition, the expression of the Fyn-SH3 functional domain does not affect the activation of SAP to NFAT signals, indicating that PIX may be another major target in the T cell signaling pathway to the combination of SAP.
Here, our study reveals that the X chromosome linked lymphoproliferative syndrome gene product SAP interacts with the guanosine conversion factor PIX of Rac/Cdc42 and participates in the T cell signaling pathway, which can help to elucidate the etiology of X linked lymphoproliferative syndrome and lay the foundation for the study of the treatment of XLP.
【學位授予單位】：上海交通大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R392

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