發(fā)布時(shí)間：2018-08-04 10:24

【摘要】： 鉤端螺旋體(以下簡(jiǎn)稱鉤體)病是世界范圍內(nèi)流行的人獸共患的自然疫源性疾病。盡管不少學(xué)者一直致力于鉤體致病機(jī)制的研究并取得一定的進(jìn)展,但人們對(duì)鉤體致病機(jī)制仍所知甚少。在許多細(xì)菌中,Ⅲ型分泌系統(tǒng)產(chǎn)物參與了對(duì)宿主細(xì)胞的粘附、侵入,誘導(dǎo)宿主細(xì)胞損傷。某些鞭毛相關(guān)蛋白也是Ⅲ型分泌系統(tǒng)家族成員。因此研究鉤體鞭毛相關(guān)基因的功能可能有助于闡明其在粘附與侵入宿主細(xì)胞過(guò)程中的致病機(jī)制。 本實(shí)驗(yàn)克隆了問(wèn)號(hào)鉤體56601株鞭毛相關(guān)基因flhA、flhB和fliR,構(gòu)建其原核表達(dá)系統(tǒng)。針對(duì)基因flhA、flhB和fliR分別設(shè)計(jì)兩對(duì)siRNA,電穿孔法導(dǎo)入鉤體內(nèi),半定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)鉤體flhA、flhB和fliR基因mRNA的表達(dá)水平。構(gòu)建插入失活型基因打靶載體,將其導(dǎo)入鉤體內(nèi),構(gòu)建flhA、flhB和fliR基因突變株。Fontana鍍銀染色法觀察鉤體56601標(biāo)準(zhǔn)株及flhA、flhB突變株粘附J774A.1細(xì)胞的能力。流式細(xì)胞術(shù)法檢測(cè)鉤體56601標(biāo)準(zhǔn)株及flhA、flhB突變株誘導(dǎo)J774A.1細(xì)胞壞死和凋亡的情況。結(jié)果表明:構(gòu)建的原核表達(dá)系統(tǒng)在IPTG誘導(dǎo)下,能夠表達(dá)目的重組蛋白rFlhA、rFlhB和rFliR。導(dǎo)入siRNA后,在熒光顯微鏡下觀察到鉤體內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光物質(zhì)。半定量RT-PCR結(jié)果顯示,flhA的兩對(duì)特異性siRNA均能抑制其mRNA的表達(dá);fliR的一對(duì)siRNA對(duì)其mRNA產(chǎn)生抑制。導(dǎo)入自殺質(zhì)粒pUC18KA和pUC18KB的鉤體能在含有卡那霉素的平板上生長(zhǎng)。問(wèn)號(hào)鉤體56601標(biāo)準(zhǔn)株和flhA、flhB突變株均可粘附J774A.1細(xì)胞,但突變株的粘附率較低。在J774A.1細(xì)胞中,flhA突變株引起細(xì)胞壞死和凋亡的比率較標(biāo)準(zhǔn)株和flhB突變株低。推測(cè)極有可能鉤體鞭毛相關(guān)基因flhA和flhB的產(chǎn)物參與了對(duì)宿主細(xì)胞的粘附、侵入、分泌毒性蛋白,從而誘導(dǎo)宿主細(xì)胞損傷。這些實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究問(wèn)號(hào)鉤體鞭毛相關(guān)基因產(chǎn)物的致病功能奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Leptospirosis (Leptospira) is a worldwide epidemic of zoonotic natural disease. Although many scholars have been working on the pathogenesis of leptospirosis and have made some progress, the pathogenesis of leptospirosis is still unknown. In many bacteria, type 鈪，

本文編號(hào)：2163627