【摘要】： 鉤端螺旋體(以下簡稱鉤體)病是世界范圍內流行的人獸共患的自然疫源性疾病。盡管不少學者一直致力于鉤體致病機制的研究并取得一定的進展,但人們對鉤體致病機制仍所知甚少。在許多細菌中,Ⅲ型分泌系統(tǒng)產物參與了對宿主細胞的粘附、侵入,誘導宿主細胞損傷。某些鞭毛相關蛋白也是Ⅲ型分泌系統(tǒng)家族成員。因此研究鉤體鞭毛相關基因的功能可能有助于闡明其在粘附與侵入宿主細胞過程中的致病機制。 本實驗克隆了問號鉤體56601株鞭毛相關基因flhA、flhB和fliR,構建其原核表達系統(tǒng)。針對基因flhA、flhB和fliR分別設計兩對siRNA,電穿孔法導入鉤體內,半定量RT-PCR技術檢測鉤體flhA、flhB和fliR基因mRNA的表達水平。構建插入失活型基因打靶載體,將其導入鉤體內,構建flhA、flhB和fliR基因突變株。Fontana鍍銀染色法觀察鉤體56601標準株及flhA、flhB突變株粘附J774A.1細胞的能力。流式細胞術法檢測鉤體56601標準株及flhA、flhB突變株誘導J774A.1細胞壞死和凋亡的情況。結果表明:構建的原核表達系統(tǒng)在IPTG誘導下,能夠表達目的重組蛋白rFlhA、rFlhB和rFliR。導入siRNA后,在熒光顯微鏡下觀察到鉤體內出現(xiàn)綠色熒光物質。半定量RT-PCR結果顯示,flhA的兩對特異性siRNA均能抑制其mRNA的表達;fliR的一對siRNA對其mRNA產生抑制。導入自殺質粒pUC18KA和pUC18KB的鉤體能在含有卡那霉素的平板上生長。問號鉤體56601標準株和flhA、flhB突變株均可粘附J774A.1細胞,但突變株的粘附率較低。在J774A.1細胞中,flhA突變株引起細胞壞死和凋亡的比率較標準株和flhB突變株低。推測極有可能鉤體鞭毛相關基因flhA和flhB的產物參與了對宿主細胞的粘附、侵入、分泌毒性蛋白,從而誘導宿主細胞損傷。這些實驗為進一步研究問號鉤體鞭毛相關基因產物的致病功能奠定了基礎。
[Abstract]:Leptospirosis (Leptospira) is a worldwide epidemic of zoonotic natural disease. Although many scholars have been working on the pathogenesis of leptospirosis and have made some progress, the pathogenesis of leptospirosis is still unknown. In many bacteria, type 鈪，

本文編號：2163626