本文選題：鉤端螺旋體 + 外腆脂蛋白��； 參考：《南華大學(xué)》2006年碩士論文

【摘要】：目的；構(gòu)建鉤端螺旋體外膜脂蛋白lipL21基因的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-lipL21，直接肌注免疫豚鼠，觀察其在豚鼠體內(nèi)所產(chǎn)生的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平，研究其對(duì)豚鼠的兔疫保護(hù)作用，為研制高效的鉤端螺旋體新型疫苗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：根據(jù)GenBank鉤端螺旋體外膜脂蛋白lipL21基因的基因序列AY187271，設(shè)計(jì)相應(yīng)特異性引物，PCR擴(kuò)增目的基因片段(561bp)，純化回收后將其插入pUCm-T載體，通過(guò)藍(lán)白斑篩選，酶切分析、PCR鑒定篩選陽(yáng)性重組體；將lipL21基因亞克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)，構(gòu)建pcDNA3.1(+)-lipL21重組體，，將其轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，用免疫細(xì)胞化學(xué)及SDS-PAGE分析鑒定lipL21在HeLa細(xì)胞中得到表達(dá)后，于0w、2w、4w將核酸疫苗pcDNA3.1(+)-lipL21及對(duì)照空質(zhì)粒pcDNA3.1(+)和對(duì)照PBS分別經(jīng)豚鼠右后腿股四頭肌肌肉注射免疫豚鼠，每次劑量為100μg／只，末次免疫后2w，以培養(yǎng)10d的56601株培養(yǎng)物從腹腔攻擊各免疫組豚鼠(2mL／只)，連續(xù)觀察15d，觀察各免疫組豚鼠的發(fā)病情況，并取各免疫組豚鼠的肺、肝、腎做病理切片，HE染色觀察比較各免疫組豚鼠的組織病理變化，分析重組體pcDNA3.1(+)-lipL21對(duì)豚鼠的免疫保護(hù)作用。并無(wú)菌分離豚鼠脾淋巴細(xì)胞，經(jīng)非特異性抗原植物血凝素(PHA)刺激后，MTT法和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)測(cè)定各免疫組豚鼠脾淋巴細(xì)胞的體外增殖情況，顯微鏡凝集試驗(yàn)(MAT法)測(cè)定各免疫組豚鼠血清中抗LipL21抗體水平，PCR法檢測(cè)lipL21基因在免疫豚鼠肌細(xì)胞內(nèi)是否存在。 結(jié)果：成功擴(kuò)增出lipL21基因，并構(gòu)建了真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-lipL21，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞48h后，免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示在HeLa細(xì)胞胞漿內(nèi)有棕黃色的陽(yáng)性產(chǎn)物，而pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞胞漿內(nèi)未觀察到棕黃色的陽(yáng)性產(chǎn)物，SDS-PAGE結(jié)果顯示目的基因能在HeLa細(xì)胞表達(dá)Mr約21kDa的蛋白。MAT結(jié)果顯示
[Abstract]:Objective: to construct eukaryotic expression vector pcDNA3.1 () -lipL21 of leptospirosis outer membrane lipoprotein (lipL21) gene, directly injected intramuscularly to immunize guinea pigs, to observe its humoral and cellular immune responses in guinea pigs, and to study its protective effect on guinea pigs. To provide experimental basis for the development of a novel vaccine against leptospira. Methods: according to the gene sequence of Leptospira leptospira outer membrane lipoprotein lip21 gene AY187271, a specific primer was designed to amplify the target gene fragment (561bp). After purification and recovery, the fragment was inserted into pUCm-T vector. LipL21 gene was subcloned into eukaryotic expression vector pcDNA3.1 (), to construct pcDNA3.1 () -lipL21 recombinant, which was transfected into HeLa cells. The expression of lipL21 in HeLa cells was identified by immunocytochemistry and SDS-PAGE analysis. The nucleic acid vaccine pcDNA3.1 () -lipL21, the control plasmid pcDNA3.1 () and the control PBS were injected intramuscularly into the quadriceps femoris muscle of the right hind leg of guinea pigs at a dose of 100 渭 g / mouse each time. Two weeks after the last immunization, 56601 strains cultured for 10 days were used to attack the guinea pigs (2mL / mouse) from the abdominal cavity. For 15 days, the incidence of the guinea pigs in each immunization group was observed, and the lungs and liver of the guinea pigs were taken out. The histopathological changes of guinea pigs in each immunized group were observed by HE staining and the protective effect of recombinant pcDNA3.1 () -lipL21 on guinea pigs was analyzed. The splenic lymphocytes of guinea pigs were isolated aseptically. The proliferation of splenic lymphocytes of guinea pigs in different immune groups was determined by MTT assay and lymphocyte transformation test after stimulation with nonspecific antigen phytohemagglutinin (PHA). Microscopical agglutination assay (mat) was used to detect the level of anti-LipL21 antibody in the serum of guinea pig immunized groups. The presence of lipL21 gene in the myocytes of immunized guinea pigs was detected by PCR. Results: lipL21 gene was successfully amplified, and the eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1 () -lipL21 was constructed. After 48 hours of transfection of the recombinant plasmid into HeLa cells, the immunocytochemical results showed that there were brown yellow positive products in the cytoplasm of HeLa cells. However, in the cytoplasm of HeLa cells transfected with pcDNA3.1 (), no brown-yellow positive product was observed. SDS-PAGE results showed that the target gene could express a protein of about 21 kDa in HeLa cells. Mat results showed that the target gene could express a protein of about 21 kDa in HeLa cells.
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類(lèi)號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2105058