本文選題：Fomalin + 小膠質(zhì)細胞��； 參考：《山西醫(yī)科大學(xué)》2007年博士論文

【摘要】： 在過去的十年里,越來越多的證據(jù)顯示膠質(zhì)細胞并不僅僅是為神經(jīng)元提供支持,調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞的代謝,調(diào)節(jié)局部神經(jīng)遞質(zhì)及離子濃度,進行神經(jīng)組織損傷的修復(fù)及參與免疫反應(yīng),同時還參與了各種神經(jīng)活動過程,包括正常生理過程的完成及疾病發(fā)生、發(fā)展的病理過程�，F(xiàn)已明確,膠質(zhì)細胞在發(fā)熱,睡眠異常,學(xué)習(xí)記憶破壞,以及神經(jīng)系統(tǒng)炎癥和神經(jīng)退行性疾病,如腦缺血、腦中風(fēng)、Alzheimer病和Parkinson病等疾病過程中發(fā)揮重要作用。新近的研究還證實,膠質(zhì)細胞參與了疼痛、尤其是慢性痛的產(chǎn)生和維持。在經(jīng)典的疼痛理論及研究過程中,研究者總是致力于探討神經(jīng)元機制并由此設(shè)計實驗并開展各種觀察,包括檢測形態(tài)結(jié)構(gòu)、物質(zhì)代謝及各種功能活動等的改變,而膠質(zhì)細胞常被排除在外。然而一個不爭的事實是,疼痛研究在經(jīng)歷了漫長的時期后,雖然已獲得大量的研究成果,但痛覺機制尤其是慢性痛的機制仍未明了,導(dǎo)致疼痛治療缺乏有效手段。隨著膠質(zhì)細胞研究的深入,越來越多的注意力開始轉(zhuǎn)向膠質(zhì)細胞,即了解膠質(zhì)細胞在各種神經(jīng)功能活動異常、包括痛覺產(chǎn)生中的作用,尤其是慢性痛、神經(jīng)病理痛發(fā)生發(fā)展中的作用,并已獲得一些有意義的結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn),皮下注射formalin或完全氟氏佐劑(CFA)、外周神經(jīng)或背根神經(jīng)節(jié)結(jié)扎、脊髓組織損傷、以及鞘內(nèi)注射HIV-1gp120,在引起機械性和熱刺激痛敏反應(yīng)的同時,也引起了脊髓背角小膠質(zhì)細胞的激活。鞘內(nèi)給予小膠質(zhì)細胞代謝抑制劑minocycline,在抑制了小膠質(zhì)細胞活化的同時,還抑制了痛覺敏感的形成。這些結(jié)果明確提示,膠質(zhì)細胞在各種疼痛模型中發(fā)揮了重要作用。與其他類型的細胞相比,小膠質(zhì)細胞對于外來或異常信號的敏感性更高,可以接受多種刺激信號包括各種傷害性刺激信號而發(fā)生反應(yīng),并最早進入活化狀態(tài)。 經(jīng)典的formalin痛模型即腳掌注射formalin,引起持續(xù)約1小時的雙相性痛行為反應(yīng)。由于該模型能較好地模擬臨床急性炎癥痛,并可采用定性或半定量的指標(biāo)對痛反應(yīng)進行測量,因而被廣泛應(yīng)用于疼痛機制的研究。但新近的研究顯示,formalin皮下注射除引起上述急性炎性痛外,還可以引起持續(xù)性的痛敏狀態(tài),持續(xù)時間遠遠超過1小時,可一直持續(xù)3到4周。在發(fā)現(xiàn)這種長時程痛敏反應(yīng)的同時,還觀察到脊髓背角小膠質(zhì)細胞的激活,持續(xù)時間與痛敏反應(yīng)時程一致。在以往的實驗觀察中,本研究室及其他研究者的觀察都證實,第一組代謝型谷氨酸受體在formalin引起的急性炎性痛中發(fā)揮重要作用。本實驗的設(shè)計目的就是在外周注射formalin的基礎(chǔ)上,通過對痛行為觀察(熱輻射刺激縮足反射潛伏期)、小膠質(zhì)細胞活化增殖的免疫組化檢測(OX-42陽性表達)和對脊髓腰膨大組織勻漿進行磷酸化p38MAPK(P-p38)的western blot檢測,結(jié)合外周及鞘內(nèi)注射第一組代謝型谷氨酸受體拮抗劑CPCCOEt(mGluR1)和MPEP(mGluR5),觀察外周和脊髓第一組代謝型谷氨酸受體在formalin所致的長時程痛敏及脊髓小膠質(zhì)細胞活化過程中可能發(fā)揮的作用。研究包括三部分內(nèi)容:1)觀察外周局部注射第一組代謝型谷氨酸受體拮抗劑對formalin引起的長時程痛敏和脊髓小膠質(zhì)細胞的活化的影響;2)觀察脊髓鞘內(nèi)注射第一組代謝型谷氨酸受體拮抗劑對formalin引起的長時程痛敏和脊髓小膠質(zhì)細胞的活化的影響;3)利用同樣的模型,觀察脊髓p38 MAPK信號途徑在第一組代謝型谷氨酸受體介導(dǎo)的長時程痛敏和小膠質(zhì)細胞活化中的作用。 第一部分外周第一組代謝型谷氨酸受體在formalin引起的長時程痛敏和脊髓小膠質(zhì)細胞活化中的作用 本實驗室前期的研究發(fā)現(xiàn),第一組代謝型谷氨酸受體參與了formalin經(jīng)外周傷害性感受器引起的急性痛行為反應(yīng)(即持續(xù)1小時的雙相痛反應(yīng))。本部分實驗擬觀察外周局部給予第一組代謝型谷氨酸受體拮抗劑包括CPCCOEt和MPEP對腳背注射formalin引起的長時程痛敏和脊髓小膠質(zhì)細胞活化的影響。 實驗在Sprague-Dawley雄性大鼠(100-120g)進行。90只大鼠分為三組,分別在formalin腳背注射前15分鐘預(yù)先在腳背皮下(便于腳掌進行熱輻射痛反應(yīng)測定)給予第一組代謝型谷氨酸受體的拮抗劑CPCCOEt(100 nmol)、MPEP(50 nmol)或作為對照的HEPES Buffer(100mM,pH7.4),然后在formalin注射后的第1、2、3、4天分別重復(fù)給予同樣劑量的藥物。各組均隨機選擇6只大鼠在formalin注射前1天,注射后2小時、1天、3天、7天、10天、2周、3周和4周進行連續(xù)的痛行為學(xué)觀察(包括formalin注射側(cè)和對側(cè));另外從各組動物中再隨機選出24只在formalin注射后2小時、1天、7天、2周、3周和4周共6個時間點(每個時間點4只)進行痛行為(包括formalin注射側(cè)及對側(cè))觀察,并分別進行脊髓腰膨大部位小膠質(zhì)細胞激活標(biāo)志物OX-42的免疫組化檢測。此后分別對所得數(shù)據(jù)進行圖像分析及統(tǒng)計學(xué)處理。 行為學(xué)觀察結(jié)果顯示,大鼠足背給予formalin(5%,50μl)后,動物即刻出現(xiàn)痛行為反應(yīng),表現(xiàn)為PWL(Paw Withdraw Latency)的縮短,2小時即出現(xiàn)了痛敏反應(yīng)的高峰并持續(xù)到在formalin注射后10天,之后恢復(fù)正常。在formalin注射后第3周再次出現(xiàn)痛覺敏感,第4周時恢復(fù)正常。在外周應(yīng)用CPCCOEt(100 nmol)或MPEP(50 nmol)之后,兩個注藥組的行為測試數(shù)據(jù)顯示PWL延長,分別與對照組相比,均在formalin注射后2小時、1天、3天具有顯著性差異(P＜0.05)。 免疫組化結(jié)果顯示,大鼠足背給予formalin后,脊髓背角小膠質(zhì)細胞在2小時后表達增加,高峰出現(xiàn)在7天,之后逐漸減弱。在外周應(yīng)用CPCCOEt(100nmol)MPEP(50nmol)之后,小膠質(zhì)細胞OX-42陽性表達明顯降低。在2小時、7天OX-42陽性表達與對照組相比均有顯著性差異(P＜0.05)。 實驗結(jié)果提示:1.formalin外周注射可形成長時程痛敏,持續(xù)時間超過2周,與此同時,觀察到脊髓背角小膠質(zhì)細胞的活化增強,提示這可能是導(dǎo)致長時程痛敏的主要原因之一;2.外周局部注射第一組代謝型谷氨酸受體拮抗劑,可阻斷或減弱了formalin導(dǎo)致的長時程痛敏和脊髓背角小膠質(zhì)細胞的激活,提示這類受體參與了formalin引起的外周痛感受器的激活。 第二部分脊髓第一組代謝型谷氨酸受體在formalin引起的長時程痛敏和脊髓小膠質(zhì)細胞活化中的作用 本研究第一部分的觀察證實,外周局部給予第一組代謝型谷氨酸受體拮抗劑可以有效抑制外周注射formalin引起的長時程痛敏和脊髓小膠質(zhì)細胞的活化。那么第一組代謝型谷氨酸受體是否在脊髓水平也參與了formalin外周注射所引起的長時程痛敏反應(yīng)和脊髓小膠質(zhì)細胞的活化呢?本部分實驗利用上述的痛模型結(jié)合鞘內(nèi)注射第一組代謝型谷氨酸受體拮抗劑對此加以證實。 實驗在Sprague-Dawley雄性大鼠(100-120g)進行,同樣進行行為學(xué)和免疫組化兩項觀察。54只大鼠分為三組,分別在formalin注射前15分鐘預(yù)先鞘內(nèi)給予第一組代謝型谷氨酸受體的拮抗劑CPCCOEt(100 nmol)、MPEP(50 nmol)或者注入HEPES Buffer作為對照(100 mM,pH7.4),然后在formalin注射后的第1、2、3、4天分別重復(fù)給予同樣劑量的藥物。各組均隨機選擇6只大鼠在formalin注射前1天,注射后2小時、1天、3天、7天、2周、3周和4周進行連續(xù)痛行為學(xué)觀察(包括formalin注射側(cè)和對側(cè)),另外從各組動物中隨機再隨機選出12只進行脊髓腰膨大部位小膠質(zhì)細胞激活標(biāo)志物OX-42的免疫組化檢測,但只設(shè)formalin注射后2小時、7天和4周共3個時間點(每個時間點4只)進行。此后對所得數(shù)據(jù)進行圖像分析及統(tǒng)計學(xué)處理。 行為學(xué)觀察結(jié)果顯示,對照組動物可出現(xiàn)痛行為反應(yīng),表現(xiàn)為PWL的縮短,同樣在2小時出現(xiàn)痛敏反應(yīng)的高峰,并持續(xù)到7天。在鞘內(nèi)分別應(yīng)用CPCCOEt(100 nmol)或MPEP(50 nmol)之后,PWL明顯延長;CPCCOEt可以有效抑制formalin注射后2小時、1天、3天和7天的痛敏,而MPEP則只抑制了formalin注射后2小時和1天的PWL縮短。免疫組化結(jié)果顯示,鞘內(nèi)應(yīng)用CPCCOEt(100 nmol)或MPEP(50 nmol)之后,formalin注射后2小時和7天的小膠質(zhì)細胞OX-42陽性表達明顯降低,與對照組相比均有顯著性差異(P＜0.05)。 實驗結(jié)果提示:1.脊髓第一組代謝型谷氨酸受體拮抗劑可以抑制formalin引起的長時程痛敏和脊髓小膠質(zhì)細胞的活化;2.在脊髓水平第一組代謝型谷氨酸受體參與了formalin引起的長時程痛敏和脊髓小膠質(zhì)細胞的活化。 第三部分第一組代謝型谷氨酸受體參與formalin引起的長時程痛敏和小膠質(zhì)細胞活化過程的機制探討—p38MAPK途徑分析 絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)是一個絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族,它可以介導(dǎo)細胞外刺激信號進入細胞,引發(fā)轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的反應(yīng)。MAPK家族主要包括ERK、p38MAPK、和c-Jun(JNK/SAPK)。p38作為MAPK的家族成員可以調(diào)控與細胞損傷(包括炎癥因子、熱休克、紫外線照射和缺血等)相關(guān)的一些病理過程。大量的研究證實,在許多疼痛模型中都有p38MAPK的活化即磷酸化過程,并且磷酸化的p38MAPK主要位于小膠質(zhì)細胞。這些結(jié)果提示,小膠質(zhì)細胞在參與疼痛的過程可能主要是通過p38MAPK通路發(fā)揮作用。本實驗在前面二部分實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上,觀察第一組代謝型谷氨酸受體是否通過p38MAPK信號途徑參與長時程痛敏和小膠質(zhì)細胞的活化。 實驗在Sprague-Dawley雄性大鼠(100-120g)進行。首先觀察formalin外周注射后脊髓p38MAPK的磷酸化過程。在formalin注射前、注射后5分鐘、15分鐘、60分鐘、1天、3天、7天、2周和4周,分別取大鼠腰膨大組織進行勻漿,利用Western blot技術(shù)觀察磷酸化p38MAPK(P-p38)的表達,用以反映p38MAPK的活化情況。結(jié)果顯示,如果以基礎(chǔ)狀態(tài)的P-p38水平作為100%,注射formalin后各時間點的P-p38的表達分別為303.78%、182.56%、101.68%、273.84%、101.22%、174.78%、104.08%、108.97%,亦即在formalin注射后5分鐘出現(xiàn)了P-p38的表達峰值,隨后恢復(fù)正常,但又在formalin注射后1天再次出現(xiàn)P-p38的表達增加之后恢復(fù)正常。 在此基礎(chǔ)上,我們又分別觀察了外周或鞘內(nèi)給予第一組代謝型谷氨酸受體的拮抗劑CPCCOEt或MPEP之后P-p38的表達情況。在formalin注射前15分鐘分別在外周或鞘內(nèi)給予CPCCOEt(100 nmol)、MPEP(50 nmol)或者HEPES(100mM,pH7.4)作為對照,之后在formalin注射后5分鐘和1天,取出動物腰膨大部位進行Western blot檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在外周或鞘內(nèi)給予CPCCOEt或MPEP之后,可以抑制formalin注射后5分鐘時的P-p38的表達增加。而對于formalin注射后1天的P-p38增加,只有在外周給予CPCCOEt時表現(xiàn)出抑制作用。 本實驗結(jié)果提示:1.formalin外周注射可以引起脊髓p38MAPK的活化,表現(xiàn)為磷酸化的p38MAPK表達增多,提示p38MAPK可能是介導(dǎo)formalin痛反應(yīng)的主要信號通路;2.外周應(yīng)用第一組代謝型谷氨酸受體拮抗劑可以抑制脊髓p38MAPK的磷酸化;3.脊髓應(yīng)用第一組代謝型谷氨酸受體拮抗劑可以抑制脊髓p38MAPK的磷酸化;4.以上結(jié)果提示提示第一組代謝型谷氨酸受體(包括外周和脊髓)通過活化脊髓p38MAPK信號通路在formalin引起的慢性痛中發(fā)揮重要作用。據(jù)我們掌握的文獻,這是首次報道第一組代謝型谷氨酸受體通過脊髓(可能是小膠質(zhì)細胞)p38MAPK在細胞水平介導(dǎo)其功能反應(yīng)。 結(jié)論:1.formalin外周注射可以引起長時程痛敏(持續(xù)時間在10天以上),同時伴有脊髓小膠質(zhì)細胞的活化;2.外周第一組代謝型谷氨酸受體的激活參與了長時程痛敏的發(fā)生和脊髓小膠質(zhì)細胞的活化;3.脊髓第一組代謝型谷氨酸受體的激活參與了formalin誘導(dǎo)的長時程痛敏的發(fā)生和脊髓小膠質(zhì)細胞的活化;4、外周和脊髓的第一組代謝型谷氨酸受體通過脊髓(可能是小膠質(zhì)細胞)的p38MAPK通路介導(dǎo)上述作用;5、結(jié)合我們以往觀察到的第一組代謝型谷氨酸受體在formalin急性痛反應(yīng)中的作用結(jié)果提示,第一組代謝型谷氨酸受體(包括外周和脊髓)在痛信號產(chǎn)生和傳遞及由此引起的痛反應(yīng)(包括急性痛反應(yīng)和慢性持續(xù)性痛反應(yīng))中發(fā)揮重要作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R33

【參考文獻】

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1 張宇,聶紅,王航,張瑞新,祁金順,喬健天;c-fos基因的反義寡聚脫氧核苷酸鞘內(nèi)注入減弱福爾馬林引起的大鼠傷害性行為反應(yīng)及脊髓背角Fos蛋白和強啡肽 A表達的研究(英文)[J];神經(jīng)解剖學(xué)雜志;2003年03期

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本文編號：2058253