本文選題：熱應激 + 燙傷��； 參考：《第二軍醫(yī)大學》2007年碩士論文

【摘要】： 熱應激可由環(huán)境溫度過高(如燒傷、燙傷)或體內的溫度增高(如發(fā)熱)所致,熱應激可以激活多條細胞內的信號轉導通路,促進應激基因的快速表達,以合成多種特異性和非特異性的對細胞具有保護作用的應激蛋白。小G蛋白RhoB是Rho亞家族的成員之一,國外近年來研究表明,RhoB是一個早期反應基因,能夠被多種基因毒應激原,如放射線、紫外線、抗癌藥(如5-氟脲嘧啶、順鉑)等誘導或使其激活。有報道RhoB上調能夠促進細胞存活、抑制細胞凋亡。但是作為非基因毒應激的熱應激是否影響RhoB的表達未見報道。本課題從在體和離體兩個水平觀察了熱應激對RhoB表達的影響,并進一步研究了RhoB表達改變的機制以及可能的生物學意義,以期為臨床燒傷、燙傷等疾病的救治提供新的靶點。 一、燙傷和熱應激能夠上調RhoB的表達 首先制備了30%體表面積III度燙傷大鼠模型,采用RT-PCR及Western blot方法檢測了肝和肺組織中RhoB mRNA及蛋白的表達情況。結果發(fā)現(xiàn),大鼠肝,肺組織中RhoB mRNA在燙傷后2h時即上調,4h時達到最大值,約為對照組的3～4倍(p0.01)。由于燙傷后體內會產生一系列的神經內分泌反應,而我們以往的實驗已證實糖皮質激素(GC)可以誘導RhoB的表達。為排除體內的神經內分泌因素,確定熱應激本身是否可直接上調RhoB,我們進一步觀察了熱應激對體外培養(yǎng)的小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞和人前列腺癌細胞系PC-3細胞中RhoB表達的影響。結果顯示,熱應激本身能以時間依賴性的方式快速地誘導這兩種體外培養(yǎng)細胞中RhoB mRNA和蛋白的表達。表明熱刺激在體內和體外都可以上調RhoB的表達,這種作用無明顯的組織細胞特異性。 二、熱應激上調RhoB表達的機制研究 以RAW264.7細胞模型,我們對熱應激上調RhoB表達的機制進行了初步探討。我們用放線菌素D抑制RAW264.7細胞的轉錄,觀察了熱應激對RhoB mRNA的穩(wěn)定性的影響,以明確熱應激誘導RhoB表達發(fā)生在轉錄水平,還是在轉錄后水平,結果顯示,在RAW264.7細胞中熱應激能使RhoB的半衰期由3.98h增加至7.6h(p0.01),表明熱應激RhoB mRNA的增加主要由RhoB的穩(wěn)定性增加所致。 已證實p38 MAPK信號通路能被包括熱應激在內的多種應激原激活,我們因而觀察了p38 MAPK的抑制劑SB203580對熱應激誘導細胞RhoB表達的影響。結果顯示,于RAW264.7細胞的培養(yǎng)液中加入SB203580抑制p38 MAPK的激活后,再將細胞進行熱應激處理,RhoB的誘導水平比沒經SB203580處理細胞降低了約50%,表明p38 MAPK通路參與了熱應激對RAW264.7細胞RhoB的誘導作用。 三、RhoB上調對SGK和HSP70表達的影響 血清和糖皮質激素調節(jié)蛋白激酶(serum and glucocorticoid-regulated protein kinase,SGK)是一個與PI-3K下游的PKB/AKT具有高度同源性的蛋白激酶,能被糖皮質激素、血清以及多種應激原所誘導,在細胞增殖、細胞存活和凋亡的信號轉導中起重要的作用。本實驗顯示,在RAW264.7細胞中,SGK也能被熱應激所誘導。因此我們進一步觀察了RhoB表達量的改變對SGK的影響,結果顯示轉染RhoB-wt質粒使RhoB過表達的細胞熱應激后,SGK mRNA的表達量比轉染空載體的細胞明顯增高(約2.1倍,p0.01),相反通過轉染siRhoB質粒抑制RhoB表達的細胞熱應激后SGK mRNA的表達量明顯減少。表明在熱應激后,RhoB的上調可能通過使SGK的表達增多,在熱應激時起促進細胞存活的作用。 熱應激能夠誘導熱休克蛋白(HSPs)的表達,HSP對于維持細胞生存、促進細胞生存具有重要的作用。我們采用上述同樣的方法觀察了熱應激前后RhoB表達量的改變對HSP70表達的影響,結果表明熱應激時RhoB表達量的改變不影響HSP70 mRNA的表達。 綜上述,本實驗發(fā)現(xiàn),熱應激能夠在整體水平和細胞水平誘導RhoB的表達,這種誘導沒有明顯組織和細胞的特異性,熱應激能夠明顯提高RhoB的穩(wěn)定性, p38 MAPK通路激活參與了RhoB表達的上調。RhoB的上調能夠促進SGK的表達,但不影響HSP70的表達,這些都顯示出RhoB具有細胞應激蛋白的特征。
[Abstract]:In recent years , it has been shown that RhoB is an early reaction gene which can be used to synthesize many kinds of specific and non - specific stress proteins , such as radiation , ultraviolet , anti - cancer drugs ( such as 5 - fluorouracil and cisplatin ) .






One , scald and heat stress can up - regulate the expression of RhoB






The expression of RhoB mRNA and protein in liver and lung tissues was detected by RT - PCR and Western blot .






Study on Mechanism of Up - regulation of RhoB Expression by Heat Stress






Using RAW264.7 cell model , we discussed the mechanism of up - regulation of RhoB expression by heat stress . The effect of heat stress on the stability of RhoB mRNA was observed by actinomycin D . The results showed that heat stress induced RhoB expression to increase from 3.98 h to 7.6 h ( p0.01 ) . The results showed that the increase of RhoB mRNA in RAW264.7 cells was mainly caused by the increase of RhoB .






It has been shown that p38 MAPK signal pathway can be activated by various types of stress including heat stress , and we have observed the effect of p38 MAPK inhibitor SB203580 on the expression of RhoB in heat stress induced cells . The results showed that the activation of p38 MAPK was inhibited by adding SB203580 to the culture solution of RAW264.7 cells . The induction of RhoB was reduced by about 50 % compared with that without SB203580 , suggesting that p38 MAPK pathway was involved in the induction of RAW264.7 cells RhoB .






The Effect of RhoB on the Expression of SGK and HSP70






Serum and glucocorticoid - regulated protein kinase ( SGK ) is a protein kinase with high homology with PKB / A downstream of PI - 3K . SGK plays an important role in the signal transduction of cell proliferation , cell survival and apoptosis .






Heat stress can induce the expression of heat shock protein ( HSPs ) , and HSP plays an important role in maintaining cell survival and promoting cell survival . The effect of the change of RhoB expression level before and after heat stress on the expression of HSP70 was observed by the same method . The results showed that the change of RhoB expression in heat stress did not affect the expression of HSP70 mRNA .






These results show that heat stress can induce RhoB expression at the whole level and cell level . This induction has no obvious tissue and cell specificity . Heat stress can obviously improve the stability of RhoB , and p38 MAPK pathway is involved in the up - regulation of RhoB expression . The up - regulation of RhoB can promote the expression of SGK , but it does not affect the expression of HSP70 , which show that RhoB has the characteristics of cell stress protein .
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R363

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本文編號：2058261