本文選題：體外 + 誘導　； 參考：《山西醫(yī)科大學》2006年碩士論文

【摘要】： 目的:研究表明,骨髓中的間充質干細胞除具備向間充質細胞分化的能力外,在一定條件下還具有向神經細胞分化的可塑性,且容易獲得和導入外源基因,因而被認為是較神經干細胞更為理想的組織工程學種子細胞和基因工程學載體細胞。但目前尚不明確其分化機制,誘導分化后的細胞功能距正常神經細胞差距較大,存活時間短,不能有效增殖,不能滿足移植需要。進一步了解骨髓間充質干細胞向神經細胞分化的具體機制如哪些基因、生物大分子等參與調控了分化,其途徑和信號傳導通路以及它們之間的相互作用和影響如何是找到確定穩(wěn)定的誘導分化方法的基礎。基于此,本實驗從成人骨髓間充質干細胞的分離、純化、擴增及誘導方案的實驗參數(shù)優(yōu)化和向神經元樣細胞方向分化中Pleiotrophin(PTN)基因表達情況進行初步探索,為進一步了解骨髓間充質干細胞的分化特性,最終實現(xiàn)其定向調控提供實驗依據(jù)。 方法: 以密度梯度離心加貼壁培養(yǎng)方法分離成人骨髓間充質干細胞(MSCs),以含20%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基進行原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng),用流式細胞儀檢測CD45、CD35、CD105以鑒定MSCs純度。取第6代的MSCs接種于培養(yǎng)板內培養(yǎng)成單層細胞,設對照組和實驗組進行預誘導和誘導實驗,誘導后30分至3天,觀察細胞形態(tài)并計數(shù)目。以免疫細胞化學法和RT-PCR法測定分化后細胞神經細胞特異性表面標志NSE、MAP-2, GFAP的表達,以鑒定是否誘導為神經元樣細胞并計算分化百分率。以RT-PCR法測定第6代MSCs向神經元樣細胞分化過程中,誘導前和誘導后3、6、12、24小時、3天PTNmRNA的表達情況。 結果: 分離的成人MSCs于細胞接種24小時后開始黏附貼壁,折光性強,呈圓形或橢圓形。3天后可見梭狀或多邊形細胞,呈集落狀生長,10～14天可基本鋪滿瓶底。傳代后生長迅速,5～6天即可鋪滿瓶底,至第5～6代時細胞呈現(xiàn)比較均一的成纖維細胞樣形態(tài)。MSCs經流式細胞儀檢測表達骨髓間充質干細胞的標志CD44、CD105,而不表達造血干細胞的特異標記CD45,從形態(tài)和表型基本證實為較純的骨髓間充質干細胞。誘導后骨髓間充質干細胞形態(tài)發(fā)生變化,寬大扁平的細胞體開始向胞核收縮;逐漸出現(xiàn)雙極及多極細胞,有細長突起。12小時后變形細胞增多,細長突起相互連接、交織。持續(xù)至24小時后變形細胞增多不明顯,至誘導后3天懸浮死亡細胞開始增多。誘導后12小時細胞免疫化學染色顯示,大部分細胞表達神經元特異性標志NSE(64.79%±0.069)、MAP-2(60.05%±0.093),而未檢測到GFAP的表達,經RT-PCR半定量檢測亦有NSEmRNA的表達(0.658±0.149)。實驗組誘導后細胞有PTNmRNA的表達而且在分化過程中的不同時點表達不同(P0.01)。在細
[Abstract]:Objective: the study shows that mesenchymal stem cells in bone marrow have the ability to differentiate into mesenchymal cells and have the plasticity of differentiation to neural cells under certain conditions, and easy to obtain and import foreign genes. Therefore, the mesenchymal stem cells are considered to be more ideal tissue engineering seed cells and gene engineering carriers than neural stem cells. But at present, the differentiation mechanism is not clear, the differentiated cell function is far apart from the normal nerve cells, and the survival time is short. It can not effectively proliferate and can not meet the needs of transplantation. Further understanding of the specific mechanism of bone marrow mesenchymal stem cells to neural cells, such as which genes, biological macromolecules and so on, is involved in the differentiation. The pathways and signal transduction pathways and their interactions and effects are the basis for finding a stable and induced differentiation method. Based on this, the experimental parameters of the isolation, purification, amplification and induction of adult bone marrow mesenchymal stem cells were optimized and Pleiotrophin (PTN) based on the direction differentiation of the cell like cells. Preliminary investigation of the expression status will provide an experimental basis for further understanding the differentiation characteristics of bone marrow mesenchymal stem cells and ultimately achieving their directional regulation.
Method:
Adult bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) were isolated by density gradient centrifugation and adherent culture method. The primary culture and passage culture were carried out with 20% fetal bovine serum DMEM medium. The purity of MSCs was identified by flow cytometry, CD45, CD35 and CD105 were detected. The sixth generation of MSCs was inoculated into the cultured monolayer cells in the culture plate, and the control group and the experimental group were set up. Pre induction and induction experiments were conducted to observe cell morphology and count the number of cells from 30 to 3 days after induction. Immunocytochemical method and RT-PCR method were used to determine the expression of specific surface markers NSE, MAP-2, and GFAP after differentiation in order to identify whether the cells were induced to be neuron like cells and calculate the percentage of differentiation. The sixth generation of MSCs was determined by RT-PCR method. During the course of cell differentiation, the expression of PTNmRNA at 3 days before induction and 3,6,12,24 hours after induction was observed.
Result:
The isolated adult MSCs began to adhere to the wall after 24 hours of cell inoculation, and the refractive index was strong. The spindle shaped or polygonal cells were found in round or elliptical.3 days. The cells were covered with colony shape and were basically covered with the bottom of the bottle at 10~14 days. After the passage, the growth of the cells was rapid, and the bottom of the bottle could be spread over 5~6 days, and the cells showed a relatively uniform fibroblast like form to the fifth ~ 6 generation. Morphology and expression of bone marrow mesenchymal stem cells (CD44, CD105) were detected by flow cytometry, but the specific marker CD45 of the hematopoietic stem cells was not expressed, and the form and phenotype were basically confirmed as bone marrow mesenchymal stem cells. After induction, the morphologic changes of bone marrow mesenchymal stem cells were changed, and the large flat cells began to shrink to the nucleus after the induction of.MSCs. Bipolar and multipolar cells gradually appeared, with elongated protuberances for.12 hours, deformable cells increased, slender protuberances were interconnected and interwoven. After 24 hours, the increase of deformable cells was not obvious, and the number of suspended cells began to increase at 3 days after induction. 12 hours after induction, cell immunocytochemical staining showed that most cells expressed neuron specific markers. The expression of GFAP was not detected in NSE (64.79% + 0.069) and MAP-2 (60.05% + 0.093), and the expression of NSEmRNA was also expressed (0.658 + 0.149) by RT-PCR semi quantitative detection. The cells in the experimental group were expressed in PTNmRNA and different at different points in the process of differentiation (P0.01).
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2006
【分類號】：R329.2

【共引文獻】

相關期刊論文 前10條

1 吳叢梅,黃天華,吳德生,謝慶東,徐小虎;pEgr-P16重組質粒的構建及其在EC9706細胞中的輻射誘導表達[J];癌變.畸變.突變;2003年04期

2 阮燁,王曉云,謝慶東,黃天華;外源DNA轉染精子的實驗研究[J];癌變.畸變.突變;2004年03期

3 歐陽松應,徐壽水,沈文律,周傳香,李春艷,歐陽紅生;人PTEN基因表達載體的構建及其在U_(251)細胞中的表達[J];癌變.畸變.突變;2004年04期

4 陳傳德,吳中亮,陳家X;乙酸鎳誘導的人支氣管上皮細胞系轉化細胞基因組不穩(wěn)定性分析[J];癌變.畸變.突變;2005年01期

5 熊小芳,黃天華,謝慶東,王曉梅,陳桂蘭;精子攜帶的HBV DNA在小鼠早期胚胎中的復制與表達[J];癌變.畸變.突變;2005年03期

6 呂慧貞;張建朋;陳新;劉靜;張元湖;;一種改進的鴨梨總RNA提取方法[J];山東農業(yè)科學;2007年05期

7 張秀華;王文鋒;;微衛(wèi)星DNA聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染技術的探討[J];山東農業(yè)科學;2009年06期

8 張學民,王金生;堿裂解法提取質粒DNA方法的改進[J];安徽大學學報(自然科學版);2000年04期

9 倪大虎,向太和,張盤娣,吳家道,楊劍波,賈士榮,余增亮;應用低能離子束將抗菌肽ShivaA基因導入恢復系明恢63的研究(簡報)[J];安徽農業(yè)科學;2000年04期

10 許曉風,郁鋒,楊啟銀,陳育如,彭榮淮,賀海生,王程輝;煙草工業(yè)下腳料綜合利用研究(I)——抗菌成分的提取與抑菌效果測定[J];安徽農業(yè)科學;2003年02期

相關會議論文 前10條

1 黃家強;卜夏;李卓婭;龔非力;;人TNFα分泌型、跨膜型和跨膜穩(wěn)定型重組體的構建表達及殺瘤效應[A];生命科學與生物技術：中國科協(xié)第三屆青年學術年會論文集[C];1998年

2 郭昱嵩;王中鐸;劉楚吾;陳志明;劉筠;;勒氏笛鯛(Lutjanus russellii)線粒體DNA全序列的測定與分析[A];中國海洋學會2007年學術年會論文集（下冊）[C];2007年

3 樊繼德;孔慶國;張梅;于喜艷;;子房注射法獲得轉基因甜瓜植株[A];中國園藝學會第七屆青年學術討論會論文集[C];2006年

4 李俊華;吳少庭;翁亞彪;甘燕;劉洪波;劉茂鈴;張仁利;高世同;黃達娜;耿藝介;;弓形蟲表面抗原SAG2基因體外擴增、克隆及在Mycobacterium smegmatis mc2155中的表達[A];全國寄生蟲學與熱帶醫(yī)學學術研討會論文集[C];2006年

5 李俊華;吳少庭;翁亞彪;甘燕;劉洪波;劉茂鈴;張仁利;高世同;黃達娜;耿藝介;;弓形蟲致密顆粒蛋白GRA4基因體外擴增、克隆及在Mycobacterium smegmatis mc2155中的表達[A];全國寄生蟲學與熱帶醫(yī)學學術研討會論文集[C];2006年

6 唐小江;馬爭;黃建勛;黃漢林;李來玉;牛僑;;正己烷引起紅細胞膜血影蛋白交聯(lián)的研究[A];中國環(huán)境誘變劑學會抗誘變劑和抗癌劑專業(yè)委員會第三次全國學術會議、中國毒理學會生化與分子毒理專業(yè)委員會第五屆學術交流會、貴州省環(huán)境誘變劑學會成立大會暨首屆學術交流會論文集[C];2004年

7 嚴家彬;李新輝;吳淑勤;杜合軍;;鱖魚病毒核酸特異片段表達及高效價抗體制備[A];可持續(xù)水產養(yǎng)殖——資源、環(huán)境、質量——2003水產科技論壇論文集[C];2003年

8 趙曉瑜;柳偉強;李曉霞;;蚯蚓抗菌肽40kDa Fetidin基因的原核表達與復性[A];2007年全國生化與生物技術藥物學術年會論文集[C];2007年

9 張核子;王保捷;丁酶;肖仰哲;巴穎;李劍平;李春梅;劉利民;賴躍;;短串聯(lián)重復位點FGA擴增片段長度多態(tài)性研究[A];第二次全國法醫(yī)物證學學術交流會論文集[C];1998年

10 胡姣;譚曉風;張琳;龍洪旭;田曉明;;油茶種子胚乳總RNA提取方法研究及改良[A];第二屆中國林業(yè)學術大會——S9 木本糧油產業(yè)化論文集[C];2009年

相關博士學位論文 前10條

1 梁勇;白念珠菌高鐵還原酶基因表達調控及Aft2p轉錄因子的功能研究[D];南開大學;2010年

2 于雙妮;胰腺癌差異表達microRNAs的鑒定及功能研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2008年

3 陳其華;前癃通膠囊治療良性前列腺增生癥臨床觀察及其對間質細胞作用的實驗研究[D];湖南中醫(yī)藥大學;2011年

4 馬麗菊;云南宣威肺癌細胞系側群細胞特征分析[D];昆明醫(yī)學院;2011年

5 許雷;大青楊纖維素合酶基因的克隆與遺傳轉化的研究[D];東北林業(yè)大學;2011年

6 朱偉;攝食抑制因子NUCB2/Nesfatin-1對機體胰島素敏感性的影響[D];重慶醫(yī)科大學;2011年

7 王金鵬;4α糖基轉移酶環(huán)化活性定向控制及其大環(huán)糊精產物的分離及應用研究[D];江南大學;2011年

8 程光平;巴馬~P唇渻生物學及遺傳學研究[D];中國海洋大學;2011年

9 宋娜;西北太平洋兩種海洋魚類的分子系統(tǒng)地理學研究及分子標記在褐牙鲆增殖放流中的應用[D];中國海洋大學;2011年

10 郭里;若干圖論問題的DNA計算機算法研究[D];湖南大學;2009年

相關碩士學位論文 前10條

1 朱曉娟;重組免疫毒素抗c-Met/PE38KDEL的構建、表達、純化及初步鑒定[D];南京醫(yī)科大學;2009年

2 錢靜;攜帶Apoptin雙調控溶瘤腺病毒治療肝癌的研究[D];浙江理工大學;2010年

3 辛寧;PDX-1真核表達載體構建及其在大鼠骨髓間充質干細胞中的表達[D];鄭州大學;2010年

4 陸玉成;AMF基因在食管鱗癌細胞株中的表達及功能初步分析[D];鄭州大學;2010年

5 呂文兵;杜氏鹽藻異養(yǎng)轉化藻株的鑒定及初步功能分析[D];鄭州大學;2010年

6 李靜;父源性HLA-A基因與子癇前期相關性研究[D];鄭州大學;2010年

7 張燕松;腎移植術后患者PBMCs中NF-κB的活性和TNF-α mRNA的表達研究[D];鄭州大學;2010年

8 張磊;杜氏鹽藻（Dunaliella salina）GPI多克隆抗體的制備及其在MDCK細胞中的定位[D];鄭州大學;2010年

9 馮玖玲;杜氏鹽藻RbcS基因家族新成員的克隆及功能研究[D];鄭州大學;2010年

10 陳操;日本七鰓鰻抗增殖蛋白Prohibitin1研究及類B淋巴細胞免疫調節(jié)初探[D];遼寧師范大學;2010年

，

本文編號：2010469