本文選題：弓形蟲 + 噬菌體肽庫技術(shù)��； 參考：《華東師范大學(xué)》2005年碩士論文

【摘要】：弓形蟲是一種全球性分布的寄生原蟲,可感染鳥類、哺乳動(dòng)物和人。人感染弓形蟲之后一般表現(xiàn)為隱性,但孕婦感染弓形蟲常會(huì)流產(chǎn)或者胎兒發(fā)育不全。此外感染了弓形蟲的人在免疫力低下時(shí)易誘發(fā)多種疾病。弓形蟲病是導(dǎo)致艾滋病患者死亡的元兇之一。弓形蟲還是畜牧業(yè)的重大危害之一。目前弓形蟲的診斷和防治仍有待完善,新型弓形蟲疫苗的研制是目前研究的重點(diǎn)。 本課題采用噬菌體隨機(jī)肽庫篩選弓形蟲抗原的模擬表位。我們用純化的兔感染弓形蟲血清作“誘餌”,從12肽和環(huán)7肽噬菌體隨機(jī)肽庫中分別篩選與該多抗有特異性結(jié)合的噬菌體,經(jīng)過三輪正向篩選和正常血清反向吸收,將噬菌體單克隆化。ELISA結(jié)果顯示,三輪篩選噬菌體得到了較有效的富集,并且親和力逐輪提高。競爭ELISA顯示第三輪篩選的噬菌體能抑制天然弓形蟲抗原與兔感染弓形蟲血清反應(yīng)。噬菌體單克隆分別和多個(gè)陽性血清、正常兔血清反應(yīng),獲得陽性克隆35個(gè)(25個(gè)12肽,10個(gè)環(huán)7肽)。和其他寄生蟲血清無交叉反應(yīng)。陽性單克隆DNA測序結(jié)果顯示有25個(gè)克隆(19個(gè)12肽,6個(gè)環(huán)7肽)具有“WH:/WHH”或“W×H”的基序,13個(gè)克隆(12肽)具有SP/S×P的基序。通過http://www.ncbi.nlm.nih.gov與天然弓形蟲抗原的基因序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)這些克隆與弓形蟲重要的保護(hù)性抗原,如表膜抗原、致密顆�？乖魻铙w蛋白、外分泌抗原等具有同源序列。根據(jù)ELISA和序列比對(duì)結(jié)果選擇10個(gè)(6個(gè)12肽,4個(gè)環(huán)7肽)克隆進(jìn)行Western Blottin、dot-ELISA檢測和免疫小鼠,結(jié)果顯示陽性克隆能特異地和兔感染弓形蟲血清反應(yīng),在約66kD處有一特異的條帶,能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生和天然弓形蟲抗原反應(yīng)的抗體,誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答,與對(duì)照組相比明顯延長了攻擊弓形蟲后的小鼠的存活時(shí)間。 通過本課題研究,我們篩選到了能與弓形蟲抗體特異性結(jié)合的噬菌體克隆,而且這些克隆無論在ELISA、Western Blotting等方法的鑒定中還是在動(dòng)物試驗(yàn)上,都顯示了它們能夠模擬天然弓形蟲抗原,而序列分析又為這個(gè)結(jié)論提供了基因水平的證據(jù)。我們推斷這些克隆有可能發(fā)展成新的具有良好特異性的弓形蟲檢測原,也為弓形蟲新型疫苗的研究打下了基礎(chǔ),提示噬菌體模擬肽可用于新型疫苗的研制。
[Abstract]:Toxoplasma gondii is a globally distributed parasite that infects birds, mammals and humans. Human infection with Toxoplasma gondii usually shows recessive, but pregnant women infected with Toxoplasma gondii often abortion or fetal dysplasia. In addition, people infected with Toxoplasma gondii are susceptible to various diseases when their immunity is low. Toxoplasma gondii is one of the main causes of AIDS deaths. Toxoplasma gondii is also one of the major hazards of animal husbandry. At present, the diagnosis and control of Toxoplasma gondii still need to be improved, and the development of new Toxoplasma vaccine is the focus of current research. A phage random peptide library was used to screen the mimic epitopes of Toxoplasma gondii antigen. Purified rabbit sera infected with Toxoplasma gondii were used as "bait". Phage peptides with 12 peptide and 7 peptide were screened from phage random peptide library, respectively. The phages with specific binding to the polyclonal antibody were screened for three rounds of positive screening and reverse absorption of normal serum. The results of phage monoclonal. Elisa showed that the phage was enriched by three rounds of screening and the affinity of phage was improved round by round. Competitive ELISA showed that the phage screened in the third round could inhibit the reaction of Toxoplasma gondii antigens to the sera of rabbits infected with Toxoplasma gondii. A total of 35 positive clones (25 12 peptides and 10 cyclic 7 peptides) were obtained from phage monoclonal reaction with several positive sera and normal rabbit serum. There was no cross reaction with other parasitic serum. The results of DNA sequencing showed that 25 clones (19 12 peptides, 6 cyclic 7 peptides) had motifs of "WH:/WHH" or "W 脳 H", and 13 clones had motifs of SP/S 脳 P. By comparing the gene sequences of http://www.ncbi.nlm.nih.gov with natural Toxoplasma gondii antigens, it was found that these clones had homologous sequences with important protective antigens, such as surface membrane antigen, dense granular antigen, coryliform protein, exocrine antigen and so on. According to the results of ELISA and sequence alignment, 10 clones (6 12 peptides and 4 cyclic 7 peptides) were selected for Western Blottinindot-ELISA assay and immunized mice. The results showed that the positive clones could react specifically with the sera of rabbits infected with Toxoplasma gondii, and there was a specific band at about 66kD. Compared with the control group, Toxoplasma gondii antibody and protective immune response were induced, and the survival time of the mice after Toxoplasma gondii attack was significantly prolonged. In this study, we have screened phage clones that can specifically bind to Toxoplasma gondii antibodies, and these clones have been identified both in the identification of Elisa Western Blotting and in animal experiments. Both show that they mimic natural Toxoplasma antigens, and sequence analysis provides evidence of the genetic level. We infer that these clones may develop into new Toxoplasma gondii detectives with good specificity and lay the foundation for the study of new Toxoplasma gondii vaccine, suggesting that phage mimic peptides can be used in the development of new vaccines.
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號(hào)】：R392;S852.72

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本文編號(hào)：1955085