本文選題：結(jié)核分枝桿菌 + 體內(nèi)誘導抗原技術(IVIAT)　； 參考：《北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所》2007年博士論文

【摘要】： 結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的傳染病,全世界約有三分之一的人口被結(jié)核桿菌感染,每年約有300萬人因此而死亡。結(jié)核病是單一致病菌引起死亡最主要原因。近年來耐多藥結(jié)核菌株的快速出現(xiàn)以及卡介苗保護的不確定性,使得控制結(jié)核病的兩條途徑——治療和預防捉襟見肘,因此,另辟蹊徑來尋找新的抗結(jié)核藥物和疫苗來擺脫目前的困境迫在眉睫。結(jié)核桿菌侵入人體后,為了適應體內(nèi)的環(huán)境,會啟動一系列基因的表達,這些基因有可能是結(jié)核桿菌逃避免疫系統(tǒng)攻擊、侵入并在吞噬細胞內(nèi)繁殖,進而引起疾病的關鍵基因。而體內(nèi)誘導抗原技術(in vivo induced antigen technology,IVIAT)可以不通過動物模型直接篩選出病原體進入人體后才特異表達的基因,這些基因有可能作為候選的免疫及藥物分子新靶位。 本實驗首先提取結(jié)核分枝桿菌(H37Rv)的基因組DNA,用Sau3A I酶切后回收片段插入到表達載體pET30a(+)、pET30b(+)和pET30c(+)中,構建H37Rv基因組表達文庫。應用IVIAT的原理,先用IPTG誘導文庫表達蛋白,然后用經(jīng)體外培養(yǎng)的H37Rv菌株和大腸桿菌BL21(DE3)吸收過的結(jié)核病人血清對該文庫進行初篩和兩輪復篩,對篩選得到的陽性克隆提取質(zhì)粒用T7啟動子引物測序,測得的序列與結(jié)核桿菌基因組數(shù)據(jù)庫比對后確定開放閱讀框。選定PPE15基因為研究對象構建基因敲除載體,然后將PPE15基因敲除載體電轉(zhuǎn)入H37Rv菌株,用卡那霉素和蔗糖進行篩選,用PCR初步鑒定PPE15基因敲除的菌株。本實驗構建了H37Rv基因組表達文庫,文庫大小為4.3×104,文庫重組質(zhì)粒含有率大于80%,達到了理論要求。 經(jīng)過篩選、測序和比對本實驗最終確定了51個開放閱讀框。按照功能分類分為8類基因:毒力、解毒及調(diào)節(jié)相關基因1個,細胞壁與細胞處理相關基因13個,中間代謝和呼吸相關基因11個,脂類代謝基因7個,信號通路基因2個,PE/PPE蛋白家族基因3個,保守假設蛋白基因12個,與牛型分枝桿菌同源的保守假設蛋白基因2個。 本實驗成功構建了結(jié)核桿菌H37Rv PPE15基因的敲除載體(pJQ200-XylE∷ΔPPE15∷Km),并將該載體電轉(zhuǎn)入到H37Rv菌株中,初步的PCR鑒定尚未得到PPE15基因突變菌株,目前該工作仍正在進行。 總之,本研究應用體內(nèi)誘導抗原技術(IVIAT)篩選到了一些結(jié)核桿菌進入人體后誘導表達的基因,并對基因的功能作了初步探討,在找尋結(jié)核桿菌在人體內(nèi)生存以及致病關鍵基因的道路上前進了一步,為結(jié)核病的預防和治療分子靶位的研究積累了有價值的資料。
[Abstract]:Tuberculosis is an infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis. About 1/3 people in the world are infected with TB, and about 3 million people die every year. Tuberculosis is the leading cause of death caused by a single pathogen. In recent years, the rapid emergence of multidrug-resistant tuberculous bacilli and the uncertainty of the protection of BCG vaccine make the treatment and prevention of tuberculosis overstretched. It is urgent to find new anti-TB drugs and vaccines to get out of the current predicament. Mycobacterium tuberculosis invades the human body, in order to adapt to the internal environment, will start a series of genes expression, these genes may be the tuberculosis bacillus escape the immune system attack, invades and propagates in the phagocyte, then causes the disease the key gene. However, in vivo induced antigen technique, vivo induced antigen technology IVIATA, can directly screen genes specifically expressed after pathogens enter human body without animal model. These genes may be used as candidate immunological and drug molecular new targets. In this experiment, the genomic DNA of Mycobacterium tuberculosis H37Rv) was extracted and inserted into the expression vectors pET30a (pET30b () and pET30c() to construct the genomic expression library of H37Rv. Using the principle of IVIAT, we first used IPTG to induce the expression of protein in the library, then screened the library with the sera of TB patients absorbed by H37Rv strain and Escherichia coli BL21DE3 in vitro. The extracted plasmid was sequenced by T7 promoter primer. The sequence was compared with the genome database of Mycobacterium tuberculosis and the open reading frame was determined. The PPE15 gene was selected as the research object to construct the gene knockout vector. Then the PPE15 gene knockout vector was transferred into H37Rv strain and screened with kanamycin and sucrose. The PPE15 gene knockout strain was preliminarily identified by PCR. The H37Rv genomic expression library was constructed in this experiment. The size of the library was 4.3 脳 10 4. The recombinant plasmid contained more than 80% of the recombinant plasmid, which met the theoretical requirements. After screening, sequencing and comparison, 51 open reading boxes were determined. According to the functional classification, there were 8 kinds of genes: virulence, detoxification and regulation related genes, cell wall and cell treatment related genes, intermediate metabolism and respiration related genes, lipid metabolism genes. There were 2 PEP / PPE family genes, 12 conserved protein genes and 2 conserved protein genes homologous to Mycobacterium bovis. In this experiment, the knockout vector pJQ200-XylE: 螖 PPE15: KMN of Mycobacterium tuberculosis H37Rv PPE15 gene was successfully constructed, and the vector was electrotransferred into H37Rv strain. The preliminary PCR identification has not yet obtained the mutant strain of PPE15 gene, and the work is still under way. In conclusion, some genes induced by Mycobacterium tuberculosis after entering human body were screened by IVIAT-induced antigen technique in vivo, and the function of the genes was preliminarily discussed. It is a step forward to search for the key genes of TB in human body and to accumulate valuable data for the study of molecular targets for prevention and treatment of tuberculosis.
【學位授予單位】：北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R378

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本文編號：1947842