本文選題：TRAIL + 原核表達(dá)　； 參考：《河南大學(xué)》2007年碩士論文

【摘要】： TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand)是屬于TNF超家族的二型跨膜蛋白,在正常人體的器官和組織中廣泛表達(dá)。它能夠引起包括腫瘤細(xì)胞及一些轉(zhuǎn)化細(xì)胞的凋亡。TRAIL和TNFα及FasL有非常高的同源性。但是TNFα及FasL分別因?yàn)槟軌蛞鹬旅缘难装Y反應(yīng),導(dǎo)致膿毒性休克癥和引起致死性肝衰竭而限制了其在臨床上的應(yīng)用。TRAIL由于能夠選擇性的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而在腫瘤生物治療上有廣泛的應(yīng)用前景。TRAIL也能和傳統(tǒng)的放化療起到協(xié)同增強(qiáng)的效應(yīng)。但是有報(bào)道稱不同形式的重組TRAIL會(huì)在抗腫瘤效應(yīng)和細(xì)胞毒性上有所不同。所以人們一方面在繼續(xù)關(guān)注TRAIL的安全性,另一方面也在積極的尋找TRAIL的替代品。而抗DR4、DR5單抗由于也能夠通過(guò)和死亡受體結(jié)合而向下傳遞凋亡信號(hào),最終引起靶細(xì)胞的凋亡而成為理想的候選者。自2001年TRA-8(抗DR5單抗)面世以來(lái),就由于其良好的抗腫瘤活性而且對(duì)正常組織細(xì)胞沒(méi)有毒性給人們很大的信心。近年來(lái)對(duì)于抗DR4,DR5的抗體,國(guó)內(nèi)外進(jìn)行了很多的研究,但是至今還沒(méi)有上市的藥物。本研究就是一方面通過(guò)分子生物學(xué)的方法實(shí)現(xiàn)兩種不同形式的人源TRAIL胞外段結(jié)構(gòu)域( 114- 281aa)在大腸桿菌中的可溶性表達(dá),一種是在其氨基末端加上多聚組氨酸標(biāo)簽和S-Tag(TRAIL-His);另一種是不加任何的外源標(biāo)簽蛋白(TRAIL-NH),并初步比較了兩種TRAIL蛋白的功能。RT-PCR法從人外周血單個(gè)核細(xì)胞中擴(kuò)增TRAIL胞外段基因,克隆入pGEM-T-Easy載體, DNA序列測(cè)定鑒定正確性。然后分別將其克隆入原核表達(dá)載體pET-30a(His)/pET-28a(NH)。采用E.coli BL21(DE3)表達(dá), Ni親和柱和離子柱分離純化目的蛋白。SDS-PAGE和Western blot鑒定原核表達(dá)產(chǎn)物。MTT法、PI染色法及瑞氏-姬姆薩染色法觀察TRAIL-His,TRAIL-NH蛋白的生物學(xué)活性。所表達(dá)目的蛋白分子量與預(yù)期蛋白分子量相一致,該蛋白可以與抗TRAIL多克隆抗體及抗組氨酸標(biāo)簽抗體反應(yīng),并可抑制人淋巴瘤細(xì)胞系Jurkat細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡。另一方面對(duì)本室獲得的一株抗DR5單抗mDRA6進(jìn)行人源化改造以擴(kuò)大其應(yīng)用前景。采用分子生物學(xué)的方法首先對(duì)抗體進(jìn)行嵌合化改造。首先用RT-PCR法從分泌mDRA6的雜交瘤中釣取可變區(qū)基因,克隆入pGEM-T-Easy載體,經(jīng)測(cè)序后,在BLAST上進(jìn)行比對(duì)證實(shí)為新的鼠源抗體。然后分別構(gòu)建嵌合抗體c-mDRA6的輕重鏈真核表達(dá)載體VHexpress、VKexpress,酶切鑒定正確后,脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞293T,經(jīng)72小時(shí)培養(yǎng)后,檢測(cè)上清表達(dá)量, c-mDRA6表達(dá)量為490ng/ml.成功的實(shí)現(xiàn)了真核表達(dá)。
[Abstract]:TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligandandis a type of transmembrane protein belonging to TNF superfamily, which is widely expressed in normal human organs and tissues. It can induce apoptosis of tumor cells and some transformed cells. Trail and TNF 偽 and FasL have very high homology. But TNF 偽 and FasL cause fatal inflammatory reactions, respectively. Septic shock and fatal liver failure limit its clinical application. Trail can be widely used in tumor biotherapy because of its ability to selectively induce tumor cell apoptosis. Trail can also be used in cancer biotherapy Radiotherapy and chemotherapy have synergistic effect. But different forms of recombinant TRAIL have been reported to differ in anti-tumor effects and cytotoxicity. So on the one hand people continue to focus on the security of TRAIL, on the other hand, they are actively looking for alternatives to TRAIL. The anti DR4 DR5 McAb is an ideal candidate for apoptosis due to its ability to pass down the apoptosis signal by binding to the death receptor and eventually to induce the apoptosis of the target cells. Since the introduction of TRA-8 (anti DR5 monoclonal antibody) in 2001, people have been confident because of its good antitumor activity and no toxicity to normal tissue cells. In recent years, a lot of research on anti-DR4 DR5 antibody has been carried out at home and abroad, but there is no drug on the market up to now. In this study, two different forms of human TRAIL extracellular domain (114-281aa) were expressed in E. coli by molecular biology. One is to add polyhistidine tag and S-Tagnil Hishe tag to its amino terminal, the other is to add no exogenous tag protein, TRAIL-NH, and to compare the function of two kinds of TRAIL proteins. RT-PCR was used to amplify the extracellular TRAIL gene from human peripheral blood mononuclear cells (PBMC). The pGEM-T-Easy vector was cloned and the DNA sequence was identified correctly. Then they were cloned into the prokaryotic expression vector pET-30aHis / pET-28aHN. The biological activity of TRAIL-His-TRAIL-NH protein was observed by E.coli BL21TDE3 expression, Ni affinity column and ion column separation and purification of the target protein. SDS-PAGE and Western blot were used to identify the prokaryotic expression product. The bioactivity of TRAIL-His-TRAIL-NH protein was observed by Pi staining and Reich's Giemsa staining. The molecular weight of the expressed target protein is consistent with that of the expected protein. The protein can react with anti TRAIL polyclonal antibody and anti histidine label antibody, and can inhibit the proliferation of human lymphoma cell line Jurkat and induce apoptosis of Jurkat cells. On the other hand, a strain of anti DR5 McAb mDRA6 obtained in our laboratory was humanized to expand its application prospect. The chimerism of antibody was first modified by molecular biology. The variable region gene was isolated from the hybridoma secreting mDRA6 by RT-PCR method and cloned into the pGEM-T-Easy vector. After sequencing, it was confirmed to be a new murine antibody by comparison on BLAST. Then, the eukaryotic expression vector of chimeric antibody c-mDRA6 was constructed respectively. After restriction endonuclease digestion, 293T was transfected into host cells by liposome method. After 72 hours of culture, the expression of supernatant was detected, and the expression of c-mDRA6 was 490ng / ml. The eukaryotic expression was successfully realized.
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類(lèi)號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：1947809