本文選題：人胰島素樣生長(zhǎng)因子-1前體 + PCR　； 參考：《南京醫(yī)科大學(xué)》2007年碩士論文

【摘要】： 目的：IGF-Ⅰ診斷試劑盒目前在國(guó)際上只有美國(guó)、德國(guó)等幾個(gè)國(guó)家生產(chǎn)，且價(jià)格極其昂貴，導(dǎo)致在國(guó)內(nèi)臨床上的應(yīng)用大大受限。本室驗(yàn)室曾選用多種載體制備IGF-Ⅰ蛋白抗原，但效果不理想，蛋白得率均比較低，給進(jìn)一步制備IGF-Ⅰ單克隆抗體及生產(chǎn)IGF-Ⅰ診斷試劑盒帶來(lái)困難。為填補(bǔ)國(guó)內(nèi)IGF-Ⅰ診斷試劑盒自主生產(chǎn)的空白，本實(shí)驗(yàn)在既往實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，選用pET32a(+)載體構(gòu)建含有人胰島素樣生長(zhǎng)因子1(human Insulin-like Growth Factor-1，hIGF-Ⅰ)前體編碼全長(zhǎng)cDNA的重組載體，使其在E.coli BL21(DE3)中表達(dá)，并對(duì)此表達(dá)菌株所表達(dá)的重組靶蛋白進(jìn)行純化，同時(shí)探討其抗原性及單抗制備中的應(yīng)用價(jià)值。 方法：1．采用PCR法，擴(kuò)增編碼hIGF-Ⅰ前體cDNA的片段，通過(guò)雙酶切、膠回收純化、連接后得到pET32a(+)／hIGF-Ⅰ重組載體。2．將其轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)的重組蛋白經(jīng)鎳柱親和層析純化。3．用western blot法檢測(cè)重組蛋白的抗原活性。 結(jié)果：重組質(zhì)粒pET32a(+)／hIGF-Ⅰ經(jīng)雙酶切鑒定和測(cè)序分析后證實(shí)構(gòu)建成功。BL21(DE3)表達(dá)的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后顯示其表達(dá)量占細(xì)菌總蛋白量的25％左右，該重組蛋白經(jīng)鎳柱親和層析純化后其純度高達(dá)90％以上。western blot結(jié)果顯示非常清晰的免疫印跡條帶，表明此重組蛋白具有免疫學(xué)特異性。 結(jié)論：pET32a(+)／hIGF-Ⅰ重組載體構(gòu)建成功，，并能夠高效表達(dá)具有免疫學(xué)特性的hIGF-Ⅰ前體蛋白，為進(jìn)一步制備IGF-Ⅰ單克隆抗體及生產(chǎn)IGF-Ⅰ診斷試劑盒打下了良好基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective at present, only the United States, Germany and other countries are producing the diagnostic kit of "1: IGF- 鈪

本文編號(hào)：1946043