本文選題：手足口病 + 柯薩奇病毒A組型　； 參考：《中國生物制品學(xué)雜志》2014年11期

【摘要】：目的應(yīng)用Bac-to-Bac桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)柯薩奇病毒A組16型(Coxsackievirus A16,CVA16)病毒樣顆粒(virus-like particle,VLP),通過條件優(yōu)化,提高VLP的表達(dá)量,純化后檢測(cè)其免疫原性。方法對(duì)CVA16結(jié)構(gòu)蛋白基因P1及蛋白酶基因3CD進(jìn)行密碼子優(yōu)化,插入啟動(dòng)子P10改造為CMV的重組桿狀病毒表達(dá)載體p Fast Bac Dual-CMV中,獲得重組穿梭質(zhì)粒p Fast Bac Dual-CMV-P1-3CD,轉(zhuǎn)化DH10 Bac TM Competent Cells,提取重組桿粒Bacmid-CMVP1-3CD,轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞,組裝成重組桿狀病毒Ac MNPV-CMV-P1-3CD,并進(jìn)行擴(kuò)增,采用間接免疫熒光法、Western blot法及透射電鏡觀察對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行初步鑒定。對(duì)重組CVA16 VLP的表達(dá)條件(病毒接種MOI值、感染時(shí)間及細(xì)胞培養(yǎng)方式)進(jìn)行優(yōu)化后,通過20%蔗糖墊層及氯化銫連續(xù)密度梯度離心法純化CVA16VLP,并通過腹部皮下注射免疫ICR小鼠3次,采用間接ELISA法檢測(cè)小鼠血清特異性Ig G抗體滴度,微量中和試驗(yàn)法檢測(cè)血清中和抗體滴度。結(jié)果重組桿狀病毒Ac MNPV-CMV-P1-3CD經(jīng)PCR及測(cè)序鑒定證實(shí)組裝成功;重組CVA16 VLP在Sf9細(xì)胞中成功表達(dá),優(yōu)化的表達(dá)條件為:重組桿狀病毒Ac MNPV-CMV-P1-3CD按MOI=5接種,Sf9細(xì)胞采用懸浮培養(yǎng)方式懸浮培養(yǎng)96 h,收集細(xì)胞及培養(yǎng)上清;純化的CVA16 VLP純度可達(dá)90%以上,針對(duì)VP2的單克隆抗體能與VP0及VP2發(fā)生特異性反應(yīng),電鏡下可見大量形態(tài)規(guī)則的類球形VLP,直徑約為27 nm;純化的CVA16 VLP免疫ICR小鼠后,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的特異性血清Ig G滴度可達(dá)1∶105,中和抗體滴度達(dá)1∶358。結(jié)論應(yīng)用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了CVA16的P1和3CD蛋白,并組裝形成完整的VLP;通過質(zhì)粒啟動(dòng)子的改造及表達(dá)條件的優(yōu)化,有效提高了CVA16 VLP的表達(dá)量;純化的CVA16 VLP可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性體液免疫應(yīng)答,為CVA16亞單位疫苗的研究提供了參考。
[Abstract]:Objective to express coxsackievirus A group 16 (Coxsackievirus A16) virus like particles like particle VLP by Bac-to-Bac baculovirus system, and to improve the expression of VLP by optimizing the conditions, and to detect its immunogenicity after purification. Methods the CVA16 structural protein gene P1 and protease gene 3CD were codon optimized and inserted into the recombinant baculovirus expression vector p Fast Bac Dual-CMV, which was transformed into CMV by promoter P10. The recombinant shuttle plasmid p Fast Bac Dual-CMV-P1-3 CD1 was obtained. The recombinant DH10 Bac TM Competent Cells, was transformed into Bacmid-CMVP1-3 CD. then transfected into Sf9 cells, the recombinant baculovirus Ac MNPV-CMV-P1-3 CD was assembled and amplified. The expression product was preliminarily identified by indirect immunofluorescence assay and transmission electron microscopy (TEM). After optimizing the expression conditions of recombinant CVA16 VLP (virus inoculation MOI value, infection time and cell culture mode), CVA16 VLP was purified by 20% sucrose cushion and cesium chloride continuous density gradient centrifugation, and ICR mice were immunized three times by abdominal subcutaneous injection. Indirect ELISA method was used to detect the titer of specific IgG antibody in serum of mice and the neutralization test was used to detect the titer of neutralized antibody in serum. Results the recombinant baculovirus ac MNPV-CMV-P1-3CD was successfully assembled by PCR and sequencing, and the recombinant CVA16 VLP was successfully expressed in Sf9 cells. The optimal expression conditions were as follows: the recombinant baculovirus ac MNPV-CMV-P1-3CD was inoculated with MOI=5 and cultured with Sf9 cells for 96 h, the cells were collected and supernatant was collected, and the purity of purified CVA16 VLP was more than 90%. Monoclonal antibodies against VP2 can react specifically with VP0 and VP2. A large number of regular spherical VLPs with a diameter of about 27 nm can be seen under electron microscope. The purified CVA16 VLP can be immunized with ICR mice. The titer of specific serum IgG and neutralizing antibody were 1: 105 and 1: 358 respectively. Conclusion the P1 and 3CD proteins of CVA16 were successfully expressed by baculovirus expression system, and the whole CVA16 VLP was assembled, and the expression level of CVA16 VLP was improved by the modification of plasmid promoter and the optimization of expression conditions. The purified CVA16 VLP can induce specific humoral immune response in mice and provide a reference for the study of CVA16 subunit vaccine.
【作者單位】： 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院北京市兒科研究所 兒科學(xué)國家重點(diǎn)學(xué)科 教育部?jī)嚎浦卮蠹膊⊙芯恐攸c(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)病毒和病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;
【基金】：(艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治科技重大專項(xiàng))病毒性傳染病病原譜流行規(guī)律及變異研究(2013ZX10004202,2012ZX10004201-003)
【分類號(hào)】：R373.23;R392-33

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本文編號(hào)：1945967