本文選題：Toll樣受體 + 氫化可的松�。� 參考：《浙江大學(xué)》2007年博士論文

【摘要】： 第一部分 糖皮質(zhì)激素對(duì)角膜上皮細(xì)胞和角膜成纖維細(xì)胞TLRs的表達(dá)和功能的調(diào)控 目的：評(píng)估糖皮質(zhì)激素對(duì)人角膜上皮細(xì)胞和角膜成纖維細(xì)胞的Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)表達(dá)和功能的影響。 方法：使用三種不同濃度的氫化可的松(1，10，100μg／ml)去刺激培養(yǎng)的人角膜上皮細(xì)胞系和角膜成纖維細(xì)胞，用RT-PCR和Real-time PCR來(lái)檢查T(mén)LR1-10的mRNA的表達(dá)，以及這種表達(dá)在不同濃度氫化可的松干預(yù)下的變化情況。用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA)來(lái)檢測(cè)兩種培養(yǎng)細(xì)胞在正常狀態(tài)下和氫化可的松干預(yù)下的IL-6，8的釋放。TLR2，3，4，9蛋白水平的表達(dá)使用熒光免疫組織化學(xué)和western blot來(lái)檢測(cè)。 結(jié)果：人角膜上皮細(xì)胞系和角膜成纖維細(xì)胞均表達(dá)TLR1-10 mRNA，但是兩種細(xì)胞表達(dá)的TLRs的量存在差異性，其中人角膜上皮細(xì)胞系TLR1，3，4高表達(dá)，TLR7，8，9，10低表達(dá)；而在人角膜成纖維細(xì)胞TLR4高度表達(dá)，TLR7，8，9，10，2表達(dá)量相當(dāng)?shù)汀Ｔ跉浠傻乃傻母深A(yù)下這兩種細(xì)胞表達(dá)TLRs明顯不同，在人角膜上皮細(xì)胞系氫化可的松能促進(jìn)大多數(shù)TLRs mRNA的表達(dá)，特別是TLR2，3，4，9；而在人角膜成纖維細(xì)胞卻表現(xiàn)為明顯抑制TLRs mRNA的表達(dá)。熒光免疫組織化學(xué)和western blot也表明氫化可的松能促進(jìn)人角膜上皮細(xì)胞系TLR2，3，4，9在蛋白水平的表達(dá)，但是在人角膜成纖維細(xì)胞卻表現(xiàn)為抑制TLR2，3，4，9在蛋白水平的表達(dá)。ELISA結(jié)果表明氫化可的松能促進(jìn)人角膜上皮細(xì)胞系IL-6在培養(yǎng)液中的釋放，同時(shí)抑制IL-8的釋放；而在人角膜成纖維細(xì)胞IL-6，8均表現(xiàn)為明顯的抑制。 結(jié)論：TLR1-10在人角膜上皮細(xì)胞系和角膜成纖維細(xì)胞均有表達(dá)，不同TLRs受體在同一細(xì)胞表達(dá)量不同，而各受體在不同細(xì)胞的表達(dá)也不同；氫化可的松能調(diào)控人角膜上皮細(xì)胞系和角膜成纖維細(xì)胞TLRs在mRNA和蛋白水平的表達(dá)，也能調(diào)控TLRs下游細(xì)胞因子IL-6，8的釋放，但是對(duì)人角膜上皮細(xì)胞系TLRs表現(xiàn)為輕度促進(jìn)，而對(duì)角膜成纖維細(xì)胞TLRs表現(xiàn)為抑制，提示了角膜的這兩種細(xì)胞在角膜天然免疫和角膜炎癥過(guò)程中發(fā)揮不同的作用；氫化可的松促進(jìn)人角膜上皮細(xì)胞系TLRs的表達(dá)和功能暗示了糖皮質(zhì)激素在天然免疫方面的一個(gè)新的功能，提示糖皮質(zhì)激素在角膜不同細(xì)胞發(fā)揮不同的免疫作用，其中對(duì)角膜上皮可能具有免疫增強(qiáng)功能，，因此局部使用糖皮質(zhì)激素在角膜上皮完整時(shí)可能有降低角膜機(jī)會(huì)性感染的可能，也可能會(huì)有益于某些特定的角膜感染，研究結(jié)果為糖皮質(zhì)激素在臨床合理應(yīng)用提供了新的依據(jù)。 第二部分 茄病鐮刀菌滅活菌絲對(duì)角膜上皮細(xì)胞TLRs的表達(dá)和功能的影響 目的：通過(guò)研究人角膜上皮細(xì)胞系在接受滅活的茄病鐮刀菌菌絲刺激后Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)的表達(dá)和功能變化，探討角膜上皮及其表達(dá)的TLRs在角膜真菌感染中的作用 方法：茄病鐮刀菌的滅活菌絲片斷按照1∶1比例來(lái)刺激培養(yǎng)的角膜上皮細(xì)胞系，細(xì)胞的TLR1-10 mRNA表達(dá)用Real-time PCR來(lái)分析，用ELISA來(lái)檢測(cè)培養(yǎng)液中的細(xì)胞因子IL-6，8；然后10μg／ml的氫化可的松被用來(lái)和滅活菌絲一起來(lái)刺激培養(yǎng)的細(xì)胞，再次分析TLR1-10 mRNA的表達(dá)和IL-6，8釋放；TLR2，4蛋白水平表達(dá)的變化用熒光免疫組織化學(xué)和western blot進(jìn)行檢查。另外用TLR2，4的單克隆抗體來(lái)阻斷TLR2，4觀察菌絲對(duì)IL-6，8釋放的影響。 結(jié)果：茄病鐮刀菌的滅活菌絲能增加上皮細(xì)胞TLR2，3，4，6 mRNAs的表達(dá)和IL-6，8的釋放，糖皮質(zhì)激素能輕度增加角膜上皮細(xì)胞TLR2和TLR4的表達(dá)和IL-6的釋放。熒光免疫組織化學(xué)和western blot結(jié)果顯示滅活菌絲片斷能促進(jìn)TLR2和TLR4蛋白水平的表達(dá)，而且這種表達(dá)能進(jìn)一步被氫化可的松上調(diào)。預(yù)先用anti-TLR2或anti-TLR4抗體封閉HCF后這兩種抗體發(fā)現(xiàn)能顯著抑制IL-6和IL-8的釋放，但是對(duì)照的同型的IgG卻沒(méi)有抑制作用，聯(lián)合使用兩種抗體能達(dá)到最大的抑制效果：IL-6被抑制78％；IL-8被抑制了82％。單獨(dú)TLR2抗體能抑制滅活菌絲誘導(dǎo)的IL-6，8分別約為68％和62％；而TLR4抗體抑制IL-6，8分別約為53％和56％。 結(jié)論：角膜上皮細(xì)胞除自身的屏障作用外，其表達(dá)的TLRs與角膜抵御真菌的天然免疫密切相關(guān)；角膜上皮的天然免疫受體TLR2，4可能在角膜上皮防御真菌感染的過(guò)程中發(fā)揮重要作用；糖皮質(zhì)激素可能增加角膜上皮TLRs表達(dá)而使角膜對(duì)真菌的侵襲力具有防御作用，研究結(jié)果對(duì)理解真菌在角膜的感染機(jī)制和進(jìn)一步研究真菌的藥物治療提供理論依據(jù)。 第三部分 人角膜成纖維細(xì)胞TLRs在茄病鐮刀菌滅活菌絲刺激后的表達(dá)和功能 目的：通過(guò)研究人角膜成纖維細(xì)胞在接受滅活的茄病鐮刀菌菌絲刺激后Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)的表達(dá)和功能變化，探討TLRs在角膜真菌感染中的作用。 方法：在培養(yǎng)的人角膜成纖維細(xì)胞中加入滅活的茄病鐮刀菌菌絲片斷，按照1∶1比例以菌絲片斷刺激細(xì)胞，使用Real-time PCR來(lái)分析成纖維細(xì)胞TLR1-10 mRNA的表達(dá)，用ELISA來(lái)檢測(cè)培養(yǎng)液中的細(xì)胞因子IL-6，8；然后使用三種不同濃度(1，10，100μg／ml)的氫化可的松和滅活菌絲一起和成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)，再次分析TLR1-10 mRNA的表達(dá)和IL-6，8釋放；TLR2，4蛋白水平表達(dá)的變化用熒光免疫組織化學(xué)檢查。另外用TLR2，4的單克隆抗體來(lái)阻斷TLR2，4觀察菌絲對(duì)IL-6，8釋放的影響。 結(jié)果：茄病鐮刀菌滅活菌絲能增加成纖維細(xì)胞的TLRs mRNA表達(dá)和上調(diào)HCF IL-6，8的釋放，而氫化可的松能抑制滅活菌絲誘導(dǎo)的TLRs mRNA的表達(dá)和IL-6，8的釋放。預(yù)先用anti-TLR2或anti-TLR4抗體封閉HCF后這兩種抗體發(fā)現(xiàn)能顯著抑制IL-6和IL-8的釋放，但是對(duì)照的同型的IgG卻沒(méi)有抑制作用，聯(lián)合使用兩種抗體能達(dá)到最大的抑制效果，IL-6抑制80％；IL-8抑制了92％。單獨(dú)TLR2抗體能抑制滅活菌絲誘導(dǎo)的IL-6，8分別約為72％和82％；而單用TLR4抗體對(duì)IL-6，8的抑制分別為64％和68％。免疫熒光組化也顯示滅活菌絲能增加輕度增加成纖維細(xì)胞TLR2，4蛋白水平的表達(dá)。 結(jié)論：角膜成纖維細(xì)胞在角膜抵御真菌感染的過(guò)程發(fā)揮重要作用，角膜成纖維細(xì)胞的天然免疫受體TLR2，4可能在角膜成纖維細(xì)胞對(duì)抗茄病鐮刀菌感染的過(guò)程中起關(guān)鍵作用，糖皮質(zhì)激素可能是通過(guò)抑制了TLRs表達(dá)而增加了真菌在角膜的侵襲力，研究結(jié)果提供了一個(gè)理解真菌性角膜炎免疫機(jī)制的重要信息，有望為真菌性角膜炎的找到一個(gè)新的免疫治療途徑 第四部分 Toll樣受體在健康角膜和單皰病毒性角膜炎的病變角膜的表達(dá) 目的：調(diào)查T(mén)oll樣受體(toll-like receptors，TLRs)在健康角膜和單皰病毒感染的活動(dòng)期和非活動(dòng)期基質(zhì)型角膜炎病變角膜的表達(dá)，探討TLRs在單皰病毒性角膜炎中可能的作用。 方法：8個(gè)單皰病毒性角膜炎(herpetic stromal keratitis，HSK)的病變角膜(包括5個(gè)活動(dòng)期和3個(gè)穩(wěn)定期)和8個(gè)健康的角膜被用來(lái)做本研究，首先我們用RT-PCR來(lái)分析TLR1-10 mRNA在健康角膜和病變角膜的表達(dá)情況，然后用相對(duì)定量的Real-time PCR來(lái)比較TLR1-10 mRNA在健康角膜和病變角膜的相對(duì)表達(dá)差異，最后我們用免疫熒光組織化學(xué)來(lái)分析在的蛋白表達(dá)在健康角膜和活動(dòng)期HSK和穩(wěn)定期HSK病變角膜的表達(dá)，數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)使用SPSS11.5來(lái)分析。 結(jié)果：使用RT-PCR和Real-time PCR分析發(fā)現(xiàn)健康角膜和HSV感染角膜均表達(dá)TLR1-10 mRNA，在健康角膜Real-time PCR顯示的了LR1，2，3，4，6 mRNA表達(dá)較高，而TLR7，8，9較低，TLR5，10居于中間。在活動(dòng)性HSK的角膜TLR1-10的均上調(diào)，特別是TLR4，7，8，9；非活動(dòng)性HSK的病變角膜除了TLR7明顯上調(diào)外，其他TLRs均表現(xiàn)為下降，特別是TLR5，6，3。熒光免疫組織化學(xué)顯示出在健康角膜和HSV感染角膜均有表達(dá)，TLR9的表達(dá)在活動(dòng)性HSV感染的角膜要稍強(qiáng)于非活動(dòng)性HSV感染角膜和健康角膜。 結(jié)論：TLRs在健康角膜和HSV感染角膜表達(dá)的差異可能在角膜的天然免疫和角膜感染免疫中發(fā)揮，TLR7可能在角膜HSK中發(fā)揮重要作用，而TLR4，8，9可能僅與HSV的活動(dòng)性感染有關(guān)，進(jìn)一步的研究TLRs可能闡明角膜HSV感染的免疫控制機(jī)制
[Abstract]:the first portion









Regulation of glucocorticoid on expression and function of TLRs in corneal epithelial cells and corneal fibroblasts









Objective : To evaluate the effect of glucocorticoid on the expression and function of Toll - like receptors ( TLRs ) in human corneal epithelial cells and corneal fibroblasts .









Methods : Three different concentrations of hydrocortisone ( 1 , 10 , 100 渭g / ml ) were used to stimulate cultured human corneal epithelial cells and corneal fibroblasts . The expression of TLR1 - 10 mRNA was examined by RT - PCR and Real - time PCR . The expression of IL - 6 , 8 was detected by enzyme - linked immunosorbent assay ( ELISA ) .









Results : TLR1 - 10 mRNA was expressed in human corneal epithelial cells and corneal fibroblasts , but there was a difference in the amount of TLRs expressed in both cells . The expression of TLR1 , 3 , 4 in human corneal epithelial cells was higher than that of TLR7 , 8 , 9 and 10 .
The expression of TLRs was very low in human corneal fibroblasts . TLRs were significantly different in TLR7 , 8 , 9 , 10 and 2 , and the expression of TLRs mRNA was promoted in human corneal epithelial cells , especially TLR2 , 3 , 4 , 9 .
The results showed that hydrocortisone can promote the expression of TLR2 , 3 , 4 , 9 in human corneal epithelial cell line TLR2 , 3 , 4 , 9 at protein level .
In human corneal fibroblasts , IL - 6 and 8 showed significant inhibition .









Conclusion : TLR1 - 10 is expressed in human corneal epithelial cell line and corneal fibroblasts , and the expression of different TLRs is different in the same cell , and the expression of each receptor in different cells is different .
hydrocortisone can regulate the expression of TLRs of human corneal epithelial cells and corneal fibroblasts at mRNA and protein levels and regulate the release of cytokines IL - 6 , 8 downstream of TLRs , but the expression of TLRs in human corneal epithelial cells is mild , and the expression of TLRs in corneal fibroblasts is inhibited , suggesting that the two cells of the cornea play different roles in the course of corneal natural immunity and keratitis .
hydrocortisone promotes the expression and function of human corneal epithelial cell line tlrs and suggests a new function of glucocorticoid in the aspect of natural immunity , which suggests that the glucocorticoid can play a different immune function in different cells of the cornea .









the second part









The effect of Fusarium moniliforme inactivated mycelium on the expression and function of TLRs in corneal epithelial cells









Objective : To investigate the expression and functional changes of Toll - like receptors ( TLRs ) in human corneal epithelial cells after stimulation of inactivated solanacoccus , and to investigate the role of TLRs in corneal fungal infections .









Methods : The expression of TLR1 - 10 mRNA in cultured corneal epithelial cells was stimulated with 1 : 1 ratio of inactivated mycelium of Fusarium moniliforme . The expression of TLR1 - 10 mRNA was analyzed by Real - time PCR , and IL - 6 and 8 were detected by ELISA .
Then 10.mu . g / ml hydrocortisone was used to stimulate cultured cells together with inactivated mycelium , and the expression of TLR1 - 10 mRNA and IL - 6 , 8 release were analyzed again .
In addition , TLR2 and 4 were used to block TLR2 and 4 to observe the effect of mycelium on the release of IL - 6 and 8 .









Results : The expression of TLR2 , 3 , 4 , 6 mRNAs and the release of IL - 6 , 8 in epithelial cell TLR2 , 3 , 4 , 6 were increased . The expression of TLR2 and TLR2 and IL - 6 in corneal epithelial cells could be significantly increased by fluorescence immunohistochemical and western blot .
IL - 8 inhibited IL - 6 , 8 % and 62 % , respectively .
The inhibition of IL - 6 , 8 was 53 % and 56 % respectively .









Conclusion : The expression of TLRs in corneal epithelial cells is closely related to the natural immunity of the cornea .
The natural immune receptor TLR2 , 4 of corneal epithelium may play an important role in corneal epithelial defense fungal infection .
Glucocorticoids may increase the expression of TLRs in the corneal epithelium , which can provide a theoretical basis for understanding the mechanism of fungal infection in the cornea and the further study of fungal drug therapy .









PART III









Expression and function of human corneal fibroblasts TLRs following stimulation of Fusarium moniliforme









Objective : To investigate the role of TLRs in corneal fungal infections by investigating the expression and functional changes of toll - like receptors ( TLRs ) in human corneal fibroblasts .









Methods : In the cultured human corneal fibroblasts , the inactivated eggplant mycelium fragment was added . The expression of TLR1 - 10 mRNA was analyzed by Real - time PCR according to the ratio of 1 : 1 , and the cytokines IL - 6 and 8 were detected by ELISA .
The expression of TLR1 - 10 mRNA and the release of IL - 6 and 8 were analyzed by using hydrocortisone and inactivated mycelium of three different concentrations ( 1 , 10 , 100 渭g / ml ) together with fibroblasts .
In addition , TLR2 , 4 monoclonal antibodies were used to block TLR2 and 4 to observe the effect of mycelium on IL - 6 , 8 release .









Results : The expression of TLRs mRNA in fibroblasts and the release of IL - 6 and 8 were inhibited by Fusarium moniliforme . The release of IL - 6 and IL - 8 was inhibited by hydrocortisone .
IL - 8 inhibited 92 % . TLR2 alone inhibited IL - 6 , 8 % and 82 % , respectively .
The inhibition of IL - 6 and 8 was 64 % and 68 % , respectively . Immunofluorescence also showed that the expression of IL - 6 and 4 - protein was increased with the increase of IL - 6 and 8 % .









Conclusion : Corneal fibroblasts play an important role in corneal defense against fungal infections . The natural immune receptor TLR2 , 4 of corneal fibroblasts play a key role in the process of corneal fibroblasts . The results provide an important information to understand the immune mechanism of fungal keratitis , which is expected to find a new way to treat fungal keratitis .









PART IV









Expression of Toll - like receptor in cornea of healthy cornea and herpes simplex keratitis









Objective : To investigate the expression of toll - like receptors ( TLRs ) in cornea of healthy cornea and herpes simplex virus and to investigate the possible role of TLRs in herpes simplex keratitis .









Methods : The expression of TLR1 - 10 mRNA in healthy cornea and lesion cornea was analyzed by RT - PCR , and the expression of TLR1 - 10 mRNA in healthy cornea and lesion cornea was analyzed by RT - PCR .









Results : TLR1 - 10 mRNA was expressed by RT - PCR and Real - time PCR . The mRNA expression of TLR1 , 2,3,4,6 mRNA was higher in healthy cornea Real - time PCR . TLR7 , 8 , 9 were lower , TLR5 and 10 were intermediate .
In addition to TLR7 , TLRs showed a decrease , especially TLR5 , 6 , 3 . The expression of TLR9 in the cornea of active HSV - infected cornea was slightly stronger than that of non - active HSV - infected cornea and healthy cornea .









Conclusion : TLRs may play an important role in the immunity of cornea and corneal infection . TLR7 may play an important role in corneal transplantation , while TLR7 may be related to the activity of HSV , and further study of TLRs may clarify the mechanism of immune control of corneal HSV infection .
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類(lèi)號(hào)】：R772.2;R392

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3 盧文玉;新月彎孢霉甾體11β-羥基化與細(xì)胞色素P450酶的研究[D];天津科技大學(xué);2004年

4 商濤;Leydig細(xì)胞中Toll樣受體（TLR）介導(dǎo)的睪丸天然免疫反應(yīng)[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2011年

5 王婭婭;β-Arrestin調(diào)控Toll樣受體—白介素1受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[D];中國(guó)科學(xué)院研究生院（上海生命科學(xué)研究院）;2006年

6 王革非;流感病毒誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的病理變化及天然免疫反應(yīng)[D];汕頭大學(xué);2008年

7 李紅日;小劑量氫化可的松對(duì)大鼠肺內(nèi)源性急性肺損傷療效的實(shí)驗(yàn)研究[D];中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2008年

8 鄭月娟;接頭蛋白Gab1通過(guò)PI3K途徑促進(jìn)TLRs和RIG-I介導(dǎo)的天然免疫反應(yīng)[D];浙江大學(xué);2009年

9 王曉娟;ConA激活的CD4~+CD25~-T淋巴細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞功能調(diào)節(jié)的實(shí)驗(yàn)研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2009年

10 王敏;新月彎孢霉的甾體11β-羥基化作用研究[D];天津科技大學(xué);2001年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 易奎星;新月彎孢霉生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)氫化可的松新工藝的研究[D];四川大學(xué);2006年

2 齊韜;同位素稀釋質(zhì)譜法測(cè)定人體血清中的葡萄糖、氫化可的松[D];北京化工大學(xué);2008年

3 范林萍;雙菌轉(zhuǎn)化RSA制氫化可的松新工藝的研究[D];蘭州大學(xué);2010年

4 孫莉;人類(lèi)新發(fā)NL63冠狀病毒木瓜樣蛋白酶調(diào)控宿主抗病毒天然免疫反應(yīng)及其分子機(jī)制[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2010年

5 金晶;ⅣfimA型牙齦卟啉單胞菌重組菌毛蛋白誘導(dǎo)HUVECs天然免疫反應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究[D];遵義醫(yī)學(xué)院;2011年

6 崔瑾;肺炎鏈球菌DnaJ對(duì)細(xì)菌毒力的影響及其在誘導(dǎo)宿主天然免疫反應(yīng)中的作用[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2012年

7 郭亞文;新月彎孢霉抗性菌株選育及P450酶特性分析[D];天津科技大學(xué);2004年

8 韓景濤;氫化可的松對(duì)人A375黑素瘤細(xì)胞株黑素合成的影響[D];南華大學(xué);2007年

9 徐旭;壓力對(duì)梨頭霉合成氫化可的松的影響[D];天津科技大學(xué);2005年

10 蔣海明;殼聚糖基透皮控釋膜的制備及控釋性能的試驗(yàn)研究[D];中南大學(xué);2004年

本文編號(hào)：1900864