本文選題：Toll樣受體 + 氫化可的松��； 參考：《浙江大學》2007年博士論文

【摘要】： 第一部分 糖皮質激素對角膜上皮細胞和角膜成纖維細胞TLRs的表達和功能的調控 目的：評估糖皮質激素對人角膜上皮細胞和角膜成纖維細胞的Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)表達和功能的影響。 方法：使用三種不同濃度的氫化可的松(1，10，100μg／ml)去刺激培養(yǎng)的人角膜上皮細胞系和角膜成纖維細胞，用RT-PCR和Real-time PCR來檢查TLR1-10的mRNA的表達，以及這種表達在不同濃度氫化可的松干預下的變化情況。用酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA)來檢測兩種培養(yǎng)細胞在正常狀態(tài)下和氫化可的松干預下的IL-6，8的釋放。TLR2，3，4，9蛋白水平的表達使用熒光免疫組織化學和western blot來檢測。 結果：人角膜上皮細胞系和角膜成纖維細胞均表達TLR1-10 mRNA，但是兩種細胞表達的TLRs的量存在差異性，其中人角膜上皮細胞系TLR1，3，4高表達，TLR7，8，9，10低表達；而在人角膜成纖維細胞TLR4高度表達，TLR7，8，9，10，2表達量相當?shù)�。在氫化可的松的干預下這兩種細胞表達TLRs明顯不同，在人角膜上皮細胞系氫化可的松能促進大多數(shù)TLRs mRNA的表達，特別是TLR2，3，4，9；而在人角膜成纖維細胞卻表現(xiàn)為明顯抑制TLRs mRNA的表達。熒光免疫組織化學和western blot也表明氫化可的松能促進人角膜上皮細胞系TLR2，3，4，9在蛋白水平的表達，但是在人角膜成纖維細胞卻表現(xiàn)為抑制TLR2，3，4，9在蛋白水平的表達。ELISA結果表明氫化可的松能促進人角膜上皮細胞系IL-6在培養(yǎng)液中的釋放，同時抑制IL-8的釋放；而在人角膜成纖維細胞IL-6，8均表現(xiàn)為明顯的抑制。 結論：TLR1-10在人角膜上皮細胞系和角膜成纖維細胞均有表達，不同TLRs受體在同一細胞表達量不同，而各受體在不同細胞的表達也不同；氫化可的松能調控人角膜上皮細胞系和角膜成纖維細胞TLRs在mRNA和蛋白水平的表達，也能調控TLRs下游細胞因子IL-6，8的釋放，但是對人角膜上皮細胞系TLRs表現(xiàn)為輕度促進，而對角膜成纖維細胞TLRs表現(xiàn)為抑制，提示了角膜的這兩種細胞在角膜天然免疫和角膜炎癥過程中發(fā)揮不同的作用；氫化可的松促進人角膜上皮細胞系TLRs的表達和功能暗示了糖皮質激素在天然免疫方面的一個新的功能，提示糖皮質激素在角膜不同細胞發(fā)揮不同的免疫作用，其中對角膜上皮可能具有免疫增強功能，，因此局部使用糖皮質激素在角膜上皮完整時可能有降低角膜機會性感染的可能，也可能會有益于某些特定的角膜感染，研究結果為糖皮質激素在臨床合理應用提供了新的依據(jù)。 第二部分 茄病鐮刀菌滅活菌絲對角膜上皮細胞TLRs的表達和功能的影響 目的：通過研究人角膜上皮細胞系在接受滅活的茄病鐮刀菌菌絲刺激后Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)的表達和功能變化，探討角膜上皮及其表達的TLRs在角膜真菌感染中的作用 方法：茄病鐮刀菌的滅活菌絲片斷按照1∶1比例來刺激培養(yǎng)的角膜上皮細胞系，細胞的TLR1-10 mRNA表達用Real-time PCR來分析，用ELISA來檢測培養(yǎng)液中的細胞因子IL-6，8；然后10μg／ml的氫化可的松被用來和滅活菌絲一起來刺激培養(yǎng)的細胞，再次分析TLR1-10 mRNA的表達和IL-6，8釋放；TLR2，4蛋白水平表達的變化用熒光免疫組織化學和western blot進行檢查。另外用TLR2，4的單克隆抗體來阻斷TLR2，4觀察菌絲對IL-6，8釋放的影響。 結果：茄病鐮刀菌的滅活菌絲能增加上皮細胞TLR2，3，4，6 mRNAs的表達和IL-6，8的釋放，糖皮質激素能輕度增加角膜上皮細胞TLR2和TLR4的表達和IL-6的釋放。熒光免疫組織化學和western blot結果顯示滅活菌絲片斷能促進TLR2和TLR4蛋白水平的表達，而且這種表達能進一步被氫化可的松上調。預先用anti-TLR2或anti-TLR4抗體封閉HCF后這兩種抗體發(fā)現(xiàn)能顯著抑制IL-6和IL-8的釋放，但是對照的同型的IgG卻沒有抑制作用，聯(lián)合使用兩種抗體能達到最大的抑制效果：IL-6被抑制78％；IL-8被抑制了82％。單獨TLR2抗體能抑制滅活菌絲誘導的IL-6，8分別約為68％和62％；而TLR4抗體抑制IL-6，8分別約為53％和56％。 結論：角膜上皮細胞除自身的屏障作用外，其表達的TLRs與角膜抵御真菌的天然免疫密切相關；角膜上皮的天然免疫受體TLR2，4可能在角膜上皮防御真菌感染的過程中發(fā)揮重要作用；糖皮質激素可能增加角膜上皮TLRs表達而使角膜對真菌的侵襲力具有防御作用，研究結果對理解真菌在角膜的感染機制和進一步研究真菌的藥物治療提供理論依據(jù)。 第三部分 人角膜成纖維細胞TLRs在茄病鐮刀菌滅活菌絲刺激后的表達和功能 目的：通過研究人角膜成纖維細胞在接受滅活的茄病鐮刀菌菌絲刺激后Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)的表達和功能變化，探討TLRs在角膜真菌感染中的作用。 方法：在培養(yǎng)的人角膜成纖維細胞中加入滅活的茄病鐮刀菌菌絲片斷，按照1∶1比例以菌絲片斷刺激細胞，使用Real-time PCR來分析成纖維細胞TLR1-10 mRNA的表達，用ELISA來檢測培養(yǎng)液中的細胞因子IL-6，8；然后使用三種不同濃度(1，10，100μg／ml)的氫化可的松和滅活菌絲一起和成纖維細胞共培養(yǎng)，再次分析TLR1-10 mRNA的表達和IL-6，8釋放；TLR2，4蛋白水平表達的變化用熒光免疫組織化學檢查。另外用TLR2，4的單克隆抗體來阻斷TLR2，4觀察菌絲對IL-6，8釋放的影響。 結果：茄病鐮刀菌滅活菌絲能增加成纖維細胞的TLRs mRNA表達和上調HCF IL-6，8的釋放，而氫化可的松能抑制滅活菌絲誘導的TLRs mRNA的表達和IL-6，8的釋放。預先用anti-TLR2或anti-TLR4抗體封閉HCF后這兩種抗體發(fā)現(xiàn)能顯著抑制IL-6和IL-8的釋放，但是對照的同型的IgG卻沒有抑制作用，聯(lián)合使用兩種抗體能達到最大的抑制效果，IL-6抑制80％；IL-8抑制了92％。單獨TLR2抗體能抑制滅活菌絲誘導的IL-6，8分別約為72％和82％；而單用TLR4抗體對IL-6，8的抑制分別為64％和68％。免疫熒光組化也顯示滅活菌絲能增加輕度增加成纖維細胞TLR2，4蛋白水平的表達。 結論：角膜成纖維細胞在角膜抵御真菌感染的過程發(fā)揮重要作用，角膜成纖維細胞的天然免疫受體TLR2，4可能在角膜成纖維細胞對抗茄病鐮刀菌感染的過程中起關鍵作用，糖皮質激素可能是通過抑制了TLRs表達而增加了真菌在角膜的侵襲力，研究結果提供了一個理解真菌性角膜炎免疫機制的重要信息，有望為真菌性角膜炎的找到一個新的免疫治療途徑 第四部分 Toll樣受體在健康角膜和單皰病毒性角膜炎的病變角膜的表達 目的：調查Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)在健康角膜和單皰病毒感染的活動期和非活動期基質型角膜炎病變角膜的表達，探討TLRs在單皰病毒性角膜炎中可能的作用。 方法：8個單皰病毒性角膜炎(herpetic stromal keratitis，HSK)的病變角膜(包括5個活動期和3個穩(wěn)定期)和8個健康的角膜被用來做本研究，首先我們用RT-PCR來分析TLR1-10 mRNA在健康角膜和病變角膜的表達情況，然后用相對定量的Real-time PCR來比較TLR1-10 mRNA在健康角膜和病變角膜的相對表達差異，最后我們用免疫熒光組織化學來分析在的蛋白表達在健康角膜和活動期HSK和穩(wěn)定期HSK病變角膜的表達，數(shù)據(jù)的統(tǒng)計使用SPSS11.5來分析。 結果：使用RT-PCR和Real-time PCR分析發(fā)現(xiàn)健康角膜和HSV感染角膜均表達TLR1-10 mRNA，在健康角膜Real-time PCR顯示的了LR1，2，3，4，6 mRNA表達較高，而TLR7，8，9較低，TLR5，10居于中間。在活動性HSK的角膜TLR1-10的均上調，特別是TLR4，7，8，9；非活動性HSK的病變角膜除了TLR7明顯上調外，其他TLRs均表現(xiàn)為下降，特別是TLR5，6，3。熒光免疫組織化學顯示出在健康角膜和HSV感染角膜均有表達，TLR9的表達在活動性HSV感染的角膜要稍強于非活動性HSV感染角膜和健康角膜。 結論：TLRs在健康角膜和HSV感染角膜表達的差異可能在角膜的天然免疫和角膜感染免疫中發(fā)揮，TLR7可能在角膜HSK中發(fā)揮重要作用，而TLR4，8，9可能僅與HSV的活動性感染有關，進一步的研究TLRs可能闡明角膜HSV感染的免疫控制機制
[Abstract]:the first portion









Regulation of glucocorticoid on expression and function of TLRs in corneal epithelial cells and corneal fibroblasts









Objective : To evaluate the effect of glucocorticoid on the expression and function of Toll - like receptors ( TLRs ) in human corneal epithelial cells and corneal fibroblasts .









Methods : Three different concentrations of hydrocortisone ( 1 , 10 , 100 渭g / ml ) were used to stimulate cultured human corneal epithelial cells and corneal fibroblasts . The expression of TLR1 - 10 mRNA was examined by RT - PCR and Real - time PCR . The expression of IL - 6 , 8 was detected by enzyme - linked immunosorbent assay ( ELISA ) .









Results : TLR1 - 10 mRNA was expressed in human corneal epithelial cells and corneal fibroblasts , but there was a difference in the amount of TLRs expressed in both cells . The expression of TLR1 , 3 , 4 in human corneal epithelial cells was higher than that of TLR7 , 8 , 9 and 10 .
The expression of TLRs was very low in human corneal fibroblasts . TLRs were significantly different in TLR7 , 8 , 9 , 10 and 2 , and the expression of TLRs mRNA was promoted in human corneal epithelial cells , especially TLR2 , 3 , 4 , 9 .
The results showed that hydrocortisone can promote the expression of TLR2 , 3 , 4 , 9 in human corneal epithelial cell line TLR2 , 3 , 4 , 9 at protein level .
In human corneal fibroblasts , IL - 6 and 8 showed significant inhibition .









Conclusion : TLR1 - 10 is expressed in human corneal epithelial cell line and corneal fibroblasts , and the expression of different TLRs is different in the same cell , and the expression of each receptor in different cells is different .
hydrocortisone can regulate the expression of TLRs of human corneal epithelial cells and corneal fibroblasts at mRNA and protein levels and regulate the release of cytokines IL - 6 , 8 downstream of TLRs , but the expression of TLRs in human corneal epithelial cells is mild , and the expression of TLRs in corneal fibroblasts is inhibited , suggesting that the two cells of the cornea play different roles in the course of corneal natural immunity and keratitis .
hydrocortisone promotes the expression and function of human corneal epithelial cell line tlrs and suggests a new function of glucocorticoid in the aspect of natural immunity , which suggests that the glucocorticoid can play a different immune function in different cells of the cornea .









the second part









The effect of Fusarium moniliforme inactivated mycelium on the expression and function of TLRs in corneal epithelial cells









Objective : To investigate the expression and functional changes of Toll - like receptors ( TLRs ) in human corneal epithelial cells after stimulation of inactivated solanacoccus , and to investigate the role of TLRs in corneal fungal infections .









Methods : The expression of TLR1 - 10 mRNA in cultured corneal epithelial cells was stimulated with 1 : 1 ratio of inactivated mycelium of Fusarium moniliforme . The expression of TLR1 - 10 mRNA was analyzed by Real - time PCR , and IL - 6 and 8 were detected by ELISA .
Then 10.mu . g / ml hydrocortisone was used to stimulate cultured cells together with inactivated mycelium , and the expression of TLR1 - 10 mRNA and IL - 6 , 8 release were analyzed again .
In addition , TLR2 and 4 were used to block TLR2 and 4 to observe the effect of mycelium on the release of IL - 6 and 8 .









Results : The expression of TLR2 , 3 , 4 , 6 mRNAs and the release of IL - 6 , 8 in epithelial cell TLR2 , 3 , 4 , 6 were increased . The expression of TLR2 and TLR2 and IL - 6 in corneal epithelial cells could be significantly increased by fluorescence immunohistochemical and western blot .
IL - 8 inhibited IL - 6 , 8 % and 62 % , respectively .
The inhibition of IL - 6 , 8 was 53 % and 56 % respectively .









Conclusion : The expression of TLRs in corneal epithelial cells is closely related to the natural immunity of the cornea .
The natural immune receptor TLR2 , 4 of corneal epithelium may play an important role in corneal epithelial defense fungal infection .
Glucocorticoids may increase the expression of TLRs in the corneal epithelium , which can provide a theoretical basis for understanding the mechanism of fungal infection in the cornea and the further study of fungal drug therapy .









PART III









Expression and function of human corneal fibroblasts TLRs following stimulation of Fusarium moniliforme









Objective : To investigate the role of TLRs in corneal fungal infections by investigating the expression and functional changes of toll - like receptors ( TLRs ) in human corneal fibroblasts .









Methods : In the cultured human corneal fibroblasts , the inactivated eggplant mycelium fragment was added . The expression of TLR1 - 10 mRNA was analyzed by Real - time PCR according to the ratio of 1 : 1 , and the cytokines IL - 6 and 8 were detected by ELISA .
The expression of TLR1 - 10 mRNA and the release of IL - 6 and 8 were analyzed by using hydrocortisone and inactivated mycelium of three different concentrations ( 1 , 10 , 100 渭g / ml ) together with fibroblasts .
In addition , TLR2 , 4 monoclonal antibodies were used to block TLR2 and 4 to observe the effect of mycelium on IL - 6 , 8 release .









Results : The expression of TLRs mRNA in fibroblasts and the release of IL - 6 and 8 were inhibited by Fusarium moniliforme . The release of IL - 6 and IL - 8 was inhibited by hydrocortisone .
IL - 8 inhibited 92 % . TLR2 alone inhibited IL - 6 , 8 % and 82 % , respectively .
The inhibition of IL - 6 and 8 was 64 % and 68 % , respectively . Immunofluorescence also showed that the expression of IL - 6 and 4 - protein was increased with the increase of IL - 6 and 8 % .









Conclusion : Corneal fibroblasts play an important role in corneal defense against fungal infections . The natural immune receptor TLR2 , 4 of corneal fibroblasts play a key role in the process of corneal fibroblasts . The results provide an important information to understand the immune mechanism of fungal keratitis , which is expected to find a new way to treat fungal keratitis .









PART IV









Expression of Toll - like receptor in cornea of healthy cornea and herpes simplex keratitis









Objective : To investigate the expression of toll - like receptors ( TLRs ) in cornea of healthy cornea and herpes simplex virus and to investigate the possible role of TLRs in herpes simplex keratitis .









Methods : The expression of TLR1 - 10 mRNA in healthy cornea and lesion cornea was analyzed by RT - PCR , and the expression of TLR1 - 10 mRNA in healthy cornea and lesion cornea was analyzed by RT - PCR .









Results : TLR1 - 10 mRNA was expressed by RT - PCR and Real - time PCR . The mRNA expression of TLR1 , 2,3,4,6 mRNA was higher in healthy cornea Real - time PCR . TLR7 , 8 , 9 were lower , TLR5 and 10 were intermediate .
In addition to TLR7 , TLRs showed a decrease , especially TLR5 , 6 , 3 . The expression of TLR9 in the cornea of active HSV - infected cornea was slightly stronger than that of non - active HSV - infected cornea and healthy cornea .









Conclusion : TLRs may play an important role in the immunity of cornea and corneal infection . TLR7 may play an important role in corneal transplantation , while TLR7 may be related to the activity of HSV , and further study of TLRs may clarify the mechanism of immune control of corneal HSV infection .
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R772.2;R392

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本文編號：1900864