發(fā)布時(shí)間：2018-05-15 04:09

  本文選題：EGS + 抗病毒　； 參考：《暨南大學(xué)》2006年博士論文

【摘要】：采用RT-PCR技術(shù)，在HCMV(AD169)感染的人胚肺成纖維細(xì)胞中檢測(cè)到了HCMVUL49mRNA，因而首次在RNA水平證實(shí)HCMV UL49基因的表達(dá)。此外，進(jìn)一步檢測(cè)不同感染時(shí)間(1h、5h、9h、12h、24h、48h和72h)受染細(xì)胞中UL49mRNA的表達(dá)情況，初步判斷UL49并非即刻早期表達(dá)基因(IE)，而可能是一個(gè)早期(β2)表達(dá)基因。 根據(jù)HCMV UL49mRNA的序列，借助計(jì)算機(jī)軟件模擬，設(shè)計(jì)了一組針對(duì)HCMV UL49mRNA不同靶位的EGS(共8個(gè)，分別命名為EGS1～EGS8)，以此作為篩選庫。通過胞外初篩、胞內(nèi)復(fù)篩和胞內(nèi)抗病毒活性的檢測(cè)，擬從中篩選出具有抗病毒活性的EGS。1)胞外初篩：首先從HeLa細(xì)胞中提取具體外切割活性的RNase P，并以此建立了一種EGS胞外篩選系統(tǒng)。通過該系統(tǒng)證實(shí)，所設(shè)計(jì)的八個(gè)EGS中，有六個(gè)EGS具有靶向引導(dǎo)切割活性，它們分別是EGS1、EGS3、EGS4、EGS5、EGS6和EGS7，其余的EGS2和EGS8則無明顯活性。在具活性的六個(gè)EGS中，各EGS的靶向引導(dǎo)切割效率有所不同。其中EGS1、EGS3、EG6和EGS7四個(gè)EGS的活性較強(qiáng)，靶向引導(dǎo)切割的效率均超過50％；而EGS4和EGS5的靶向引導(dǎo)切割效率則均低于50％。2)胞內(nèi)復(fù)篩中：首先將UL49基因克隆至pGEFP-N1質(zhì)粒綠色熒光蛋白基因的上游，以構(gòu)建UL49-綠色熒光蛋白融合表達(dá)載體(pUL49／EGFP-N1)。將EGS與該融合蛋白表達(dá)載體以脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞(同時(shí)以紅色熒光質(zhì)粒pDsRed2-C1，作為轉(zhuǎn)染的內(nèi)對(duì)照)，建立了一種有效的EGS胞內(nèi)復(fù)篩系統(tǒng)。通過熒光顯微觀察、Typhoon掃描及流式細(xì)胞儀檢測(cè)，證實(shí)胞外初篩中活性較強(qiáng)的四個(gè)EGS中，只有EGS1、EGS3和EGS6具有明顯的胞內(nèi)靶向抑制活性，而EGS7的活性則較弱。3)胞內(nèi)抗病毒活性的檢測(cè)：將初篩及復(fù)篩證實(shí)有效的EGS分別以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HELF細(xì)胞，然后再以AD169病毒株感染。在感染24h、48h和72h后，抽提感染細(xì)胞的總RNA，以相對(duì)熒光定量PCR(β-actin作內(nèi)參)檢測(cè)其中HCMVUL49mRNA的含量。結(jié)果表明：EGS1、EGS3、EGS6和EGS7對(duì)HCMV UL49mRNA表達(dá)的抑制率分別為74.87±2.85％、17.85±4.16％、89.77±0.91％和35.40±1.92％。其中，EGS1和EGS6的靶向抑制活性明顯高于其余兩個(gè)EGS(P＜0.01)。進(jìn)一步以EGS1和EGS6作為研究對(duì)象，通過絕對(duì)熒光定量PCR的方法檢測(cè)EGS轉(zhuǎn)染后病毒培養(yǎng)液中HCMV基因組DNA的變化，，以此評(píng)價(jià)EGS1及EGS6對(duì)胞內(nèi)HCMV復(fù)制的抑制活性。結(jié)果顯示，E6S1和EGS6轉(zhuǎn)染后，病毒的增殖曲線均明顯低于未轉(zhuǎn)染EGS的對(duì)照組。從而證實(shí)了EGS1和EGS6在胞內(nèi)的抗病毒效應(yīng)。其中，EGS6的抑制作用較強(qiáng)(抑制率為89.62±2.55％～95.9±1.98％)，EGS1的抑制作用則相對(duì)較弱(抑制率為40.25±1.05％～70.85±2.03％)。 總之，通過本研究一系列的篩選步驟，獲得兩種具有胞內(nèi)抗HCMV活性的EGS序列(EGS1和EGS6)，從而為新型抗HCMV反義藥物的進(jìn)一步研究與開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:HCMVUL49mRNAs were detected in human embryonic lung fibroblasts infected with RT-PCR technique, and the expression of HCMV UL49 gene was confirmed for the first time at RNA level. In addition, the expression of UL49mRNA in the infected cells was further detected at different infection time (1h, 5h, 9h, 12h, 24h, 48h, 72h). It was preliminarily determined that UL49 was not an immediate early expressed gene, but an early (尾 _ 2) expression gene. According to the sequence of HCMV UL49mRNA and computer software simulation, a set of EGSs (eight EGS1s EGS8) for different targets of HCMV UL49mRNA were designed and used as the screening library. The extracellular screening, the intracellular screening and the detection of intracellular antiviral activity were carried out. The extracellular screening of EGS.1 with antiviral activity was proposed. Firstly, specific extracellular RNase Ps were extracted from HeLa cells, and a EGS extracellular screening system was established. It was confirmed by the system that six of the eight EGS designs had targeted guided cleavage activity, which were EGS1, EGS3, EGS4, EGS5, EGS6 and EGS7, while the rest EGS2 and EGS8 had no obvious activity. In the six active EGS, the efficiency of targeted guide cutting of each EGS is different. Among them, EGS1, EGS3, EG6 and EGS7 have strong activity, and the efficiency of targeting guided cleavage is more than 50%, while that of EGS4 and EGS5 is lower than that of 50%. 2) the UL49 gene is first cloned into the upstream of the pGEFP-N1 plasmid green fluorescent protein gene. To construct the fusion expression vector of UL49-green fluorescent protein, pUL49 / EGFP-N1. The expression vector of EGS and the fusion protein was co-transfected into HeLa cells with liposome (and the red fluorescent plasmid pDsRed2-C1 was used as the transfection internal control) to establish an effective EGS intracellular screening system. By fluorescence microscopy, Typhoon scanning and flow cytometry analysis showed that of the four EGS with strong activity in the extracellular screen, only EGS1, EGS3 and EGS6 had obvious intracellular targeted inhibitory activities. But the activity of EGS7 was weaker. 3) the detection of intracellular antiviral activity: the EGS which was proved to be effective by primary screening and rescreening was transfected into HELF cells by liposome, and then infected by AD169 virus strain. The total RNAs of infected cells were extracted for 48 h and 72 h after infection, and the content of HCMVUL49mRNA was detected by relative fluorescence quantitative PCR (尾 -actin as internal control). The results showed that the inhibition rates of EGS6 and EGS7 on HCMV UL49mRNA expression were 74.87 鹵2.85 and 17.85 鹵4.16, respectively, 89.77 鹵0.91% and 35.40 鹵1.92%, respectively. The targeted inhibitory activities of EGS1 and EGS6 were significantly higher than those of the other two EGS(P < 0.01. Furthermore, EGS1 and EGS6 were used to detect the changes of HCMV genomic DNA in the culture medium after EGS transfection with absolute fluorescence quantitative PCR (PCR) to evaluate the inhibitory activity of EGS1 and EGS6 on the intracellular HCMV replication. The results showed that after transfection of E6S1 and EGS6, the proliferation curve of the virus was significantly lower than that of the control group without EGS transfection. Therefore, the antiviral effects of EGS1 and EGS6 in cells were confirmed. The inhibitory rate of EGS6 was stronger (the inhibitory rate was 89.62 鹵2.55) and the inhibitory effect of EGS1 was relatively weak (the inhibitory rate was 40.25 鹵1.05 鹵70.85 鹵2.03). In conclusion, through a series of screening steps in this study, two EGS sequences, EGS1 and EGS6, with intracellular HCMV activity were obtained, which laid a foundation for the further research and development of new antisense drugs against HCMV.
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號(hào)】：R346

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本文編號(hào)：1890893