本文選題：松果體 + 血管周隙�。� 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2007年博士論文

【摘要】： 松果體細(xì)胞帶有突起,含有分泌顆粒;而且,支配松果體的神經(jīng)纖維,也可以釋放神經(jīng)肽;因此,松果體內(nèi)肽類物質(zhì),是位于松果體細(xì)胞,還是位于支配松果體的神經(jīng)纖維,目前仍不十分確切。人們普遍認(rèn)為,肽類激素分泌顆粒,是以胞吐分泌的方式釋放;但也有學(xué)者認(rèn)為,肽類激素分泌顆粒的釋放形式,可能存在連同顆粒被膜的整體釋放。由于松果體的毛細(xì)血管為窗孔型,相對缺乏血腦屏障,故多數(shù)學(xué)者認(rèn)為,松果體細(xì)胞釋放的分泌物,立即進入血液循環(huán);也有學(xué)者認(rèn)為,松果體分泌的褪黑素,可以直接釋放到第三腦室或蛛網(wǎng)膜下隙的腦脊液中。對人和牛等的血液和腦脊液中,褪黑素濃度的分析表明,腦脊液中濃度通常高于血液數(shù)倍;所以,褪黑素有可能被直接釋放入腦脊液,從而最快最有效地到達腦內(nèi)的作用靶點。本研究課題,旨在探討松果體肽類激素的化學(xué)性質(zhì)和釋放形式,觀察松果體分泌物直接釋放到蛛網(wǎng)膜下隙腦脊液途徑的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ);為進一步闡明松果體的功能,也為臨床相關(guān)疾病的診治,提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。 一、大鼠松果體細(xì)胞原代培養(yǎng)體系的建立 目的:建立體外培養(yǎng)的大鼠松果體細(xì)胞系,觀察培養(yǎng)的松果體細(xì)胞在生長、增殖和功能狀態(tài)等生物學(xué)方面的變化,探討培養(yǎng)松果體細(xì)胞的最佳生長和功能狀態(tài)時機,為擺脫神經(jīng)及體液等因素對松果體的影響、揭示松果體細(xì)胞自身合成和分泌肽類激素,提供實驗研究依據(jù)。 方法:于春季上午9:00~10:00,將頸椎脫臼法處死的生后1~3天SD乳鼠,經(jīng)75%乙醇消毒后,將顱骨骨片向前掀起,游離粘連于顱骨上的松果體淺部,剝除腦膜及血管;將松果體剪碎,離心后加入0.125%胰酶和0.02%EDTA混合消化液,37℃消化15min;加入含10%新生牛血清、青霉素100IU/ml和鏈霉素100IU/ml的DMEM/F12培養(yǎng)液,終止胰酶消化,制備成單細(xì)胞懸液;接種于放有蓋玻片的六孔板中,置于37℃含5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi),在上述混合培養(yǎng)基中培養(yǎng);分別在接種后的第3、7、10、13天,半量更換混合培養(yǎng)基。每天定時在倒置顯微鏡下觀察其生長情況;取培養(yǎng)第12天的細(xì)胞爬片,行免疫細(xì)胞化學(xué)染色,4%多聚甲醛固定1h,1%TritonX-100室溫30min,一抗為兔抗人多克隆5-HT抗體工作液,4℃過夜;二抗為生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG工作液;應(yīng)用辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液、DAB顯色;采用0.125%胰酶和0.02%EDTA混合消化液消化法,取培養(yǎng)到第15天的細(xì)胞,2 %多聚甲醛和2.5 %戊二醛混合固定液,4℃固定3h,進行常規(guī)TEM樣品的制備與觀察;取培養(yǎng)第15天的細(xì)胞爬片,1%戊二醛4℃固定1h,梯度乙醇脫水,自然干燥后鍍金,SEM觀察。 結(jié)果:在倒置顯微鏡下觀察顯示,在接種6h后,培養(yǎng)細(xì)胞貼壁;接種后的4天內(nèi),貼壁細(xì)胞增殖緩慢;接種后第5~6天,細(xì)胞增殖加快;在接種后的第7~8天,出現(xiàn)典型的培養(yǎng)細(xì)胞巢,為較暗的圓形、橢圓形、三角形或多角形的松果體細(xì)胞;在成纖維樣細(xì)胞層的上方中央,呈鋪路卵石樣密集排列;第8~12天,細(xì)胞增殖旺盛,形成許多面積大小不一、細(xì)胞數(shù)量不等的細(xì)胞巢;在第12~15天,分散的、呈片狀的成纖維樣細(xì)胞層逐漸融合,其上的細(xì)胞巢內(nèi)呈鋪路卵石樣排列的細(xì)胞逐漸分散,細(xì)胞巢變得不典型。在細(xì)胞巢的周邊和細(xì)胞巢的空穴內(nèi),可見少量胞體較大、突起粗大的多邊形神經(jīng)膠質(zhì)樣細(xì)胞。在培養(yǎng)第12天的細(xì)胞爬片上,可見5-HT免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞,外觀似雙極神經(jīng)元。TEM觀察顯示,體外培養(yǎng)15天的松果體細(xì)胞內(nèi),有豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和游離核糖體、密集的線粒體、少量直徑300nm左右的膜包密芯分泌顆粒;在細(xì)胞質(zhì)內(nèi),還可見到許多大小不等的囊泡。在體外培養(yǎng)15天的細(xì)胞爬片上,SEM觀察顯示,可見梭形和近似球形的松果體細(xì)胞。 結(jié)論:實驗建立了大鼠松果體細(xì)胞體外培養(yǎng)體系,方法簡單易行、價格低廉。在培養(yǎng)的第7~8天,出現(xiàn)典型的細(xì)胞巢,為較暗的圓形、橢圓形、三角形或多角形松果體細(xì)胞,位于成纖維樣細(xì)胞層的上方中央,呈鋪路卵石樣密集排列。培養(yǎng)10～15天時,細(xì)胞生長狀況較好,是進行免疫細(xì)胞化學(xué)研究,或做透射電鏡觀察的最佳時機。 二、大鼠松果體內(nèi)生長抑素免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞和纖維的觀察 目的:由于松果體細(xì)胞帶有突起,又含有分泌顆粒;而且,支配松果體的神經(jīng)纖維,也可以釋放神經(jīng)肽。然而,松果體內(nèi)的肽類物質(zhì),是位于松果體細(xì)胞內(nèi),還是位于支配松果體的神經(jīng)纖維內(nèi),目前仍不十分清楚。為此,本文旨在探討松果體細(xì)胞,是否自身能夠合成與分泌生長抑素樣抑制性激素。 方法: 1松果體內(nèi)生長抑素的免疫細(xì)胞化學(xué)觀察 取15天齡SD大鼠,于春季上午9 : 00～11 :00,腹腔注射20 %烏拉坦麻醉下,左心室插管快速灌流0.9%溫生理鹽水,再用4℃的4%多聚甲醛灌注約1h,斷頭取松果體淺部,置于4℃的4%多聚甲醛中72h;冰凍切片,片厚14μm;1%TritonX-100室溫30min,一抗為兔抗人多克隆生長抑素抗體工作液,4℃反應(yīng)68h,二抗為生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG工作液;辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液和DAB顯色。 2生長抑素在培養(yǎng)大鼠松果體細(xì)胞的表達 取新生SD大鼠松果體,進行松果體細(xì)胞培養(yǎng);取培養(yǎng)第12天的細(xì)胞爬片,4%多聚甲醛中固定1h,1%TritonX-100室溫30min,一抗為兔抗人多克隆生長抑素抗體工作液,4℃反應(yīng)36 h,二抗為生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG工作液;辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液和DAB顯色。 3松果體內(nèi)生長抑素的免疫金電鏡觀察 取新生SD大鼠,于春季上午9 : 00～11 :00,斷頭,取松果體淺部,4℃的3 %多聚甲醛和1 %戊二醛中固定60min,4℃的4 %多聚甲醛中再固定2h;然后進行常規(guī)TEM樣品包埋,超薄切片載于鑷網(wǎng)上;一抗為兔抗人多克隆生長抑素杭體工作液,4℃反應(yīng)70h;膠體金(15nm)標(biāo)記羊抗兔IgG稀釋液(1:10),37℃反應(yīng)60min;醋酸鈾和枸櫞酸鉛染色,透射電鏡觀察。 結(jié)果: 1松果體內(nèi)生長抑素的免疫細(xì)胞化學(xué)觀察 在15天齡的大鼠松果體,可見數(shù)量稀少的生長抑素免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞,其外觀呈橢圓形或三角形,胞體直徑大于其它背景染色細(xì)胞;其中有些陽性細(xì)胞,發(fā)出1~2條細(xì)長、生長抑素免疫反應(yīng)陽性突起,走行于松果體實質(zhì)細(xì)胞之間。在松果體實質(zhì)細(xì)胞之間,偶爾可以見到結(jié)節(jié)狀膨大的、生長抑素免疫反應(yīng)陽性纖維。 2生長抑素在培養(yǎng)大鼠松果體細(xì)胞的表達 在體外培養(yǎng)第12天的細(xì)胞爬片上,可以見到生長抑素免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞;其胞體外觀呈圓形、橢圓形、三角形或梭形,從胞體上發(fā)出2~3條細(xì)長的、生長抑素免疫反應(yīng)陽性的突起。 3松果體內(nèi)生長抑素的免疫金電鏡觀察 在生后1天的大鼠,松果體的實質(zhì)細(xì)胞,主要由松果體細(xì)胞構(gòu)成;其中,只有少量松果體細(xì)胞,含有大型致密核芯分泌顆粒,這些分泌顆粒的數(shù)量較少,在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈散在分布或數(shù)個成堆分布。在應(yīng)用樹酯包埋后染色、免疫金電鏡技術(shù)所做的超薄切片上,可在某些松果體細(xì)胞的胞漿內(nèi),觀察到散在分布的或聚集成堆的標(biāo)記金顆粒。 結(jié)論:在大鼠松果體內(nèi),存在生長抑素免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞和纖維。少量松果體細(xì)胞內(nèi),含有大型致密核芯分泌顆粒。少量松果體細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi),含有生長抑素免疫反應(yīng)陽性物質(zhì)。有些體外培養(yǎng)的松果體細(xì)胞,可以合成和分泌生長抑素。 三、大鼠松果體分泌物釋放入蛛網(wǎng)膜下隙腦脊液途徑的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ) 目的:哺乳動物的松果體,富含窗孔型毛細(xì)血管,相對缺乏血腦屏障。因此,多數(shù)學(xué)者認(rèn)為,松果體細(xì)胞釋放的分泌物,立即進入血管并經(jīng)血液循環(huán)運輸。由于人蛛網(wǎng)膜下隙腦脊液中的褪黑素濃度,顯著高于血液中濃度;因此,松果體分泌物有可能通過腦脊液,直接到達腦內(nèi)的作用靶點。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為,多肽激素的分泌顆粒,是以胞吐分泌的方式釋放,但是也有學(xué)者認(rèn)為,可能存在連同顆粒被膜的整體釋放。為此,本文對大鼠松果體的細(xì)微和超微結(jié)構(gòu)特點進行觀察,為松果體細(xì)胞分泌顆粒的釋放形式和轉(zhuǎn)運途徑,以及與蛛網(wǎng)膜下隙腦脊液的關(guān)系,提供形態(tài)學(xué)證據(jù)。 方法:于春季上午9:00～11:00,SD大鼠在腹腔注射20%烏拉坦麻醉下,直接斷頭取松果體淺部,12月齡大鼠的松果體,置于4℃的3 %多聚甲醛和1 %戊二醛溶液中,浸泡固定48 h,然后進行常規(guī)TEM樣品的制備與觀察;1.5月齡和12月齡的大鼠松果體,置于4℃的2 %多聚甲醛和2.5 %戊二醛混合固定液中,浸泡固定48h,然后進行松果體囊表面的常規(guī)SEM樣品制備與觀察;同時,12月齡大鼠在烏拉坦麻醉下,經(jīng)左心室插管,快速灌注0.9%溫生理鹽水沖洗后,斷頭取松果體淺部,移入1%鋨酸4℃固定1h,然后進行DMSO冷凍割斷法的SEM樣品制備及觀察。 結(jié)果: 1 TEM觀察 TEM觀察顯示,大鼠松果體毛細(xì)血管為窗孔型(孔徑50nm),借基膜與寬闊的血管周隙分隔;松果體細(xì)胞與結(jié)締組織之間,也有基膜相互分隔,相鄰的松果體細(xì)胞則緊密相貼。在松果體細(xì)胞的連接面之間,局部細(xì)胞膜凹陷,形成大量管徑不等的細(xì)胞間小管;其管腔面比較光滑,無基膜覆蓋,有些小管內(nèi)可見到膜殼和膜碎片樣結(jié)構(gòu)。但是,在構(gòu)成細(xì)胞間小管的松果體細(xì)胞之間,未觀察到緊密連接。松果體細(xì)胞間小管,與松果體內(nèi)結(jié)締組織間隙和血管周隙互相連通。松果體囊與軟腦膜相延續(xù),由扁平的囊上皮細(xì)胞和上皮下結(jié)締組織構(gòu)成;在上皮下結(jié)締組織間隙內(nèi),可見松果體細(xì)胞的胞體及突起等結(jié)構(gòu)。松果體囊扁平上皮細(xì)胞的排列,呈現(xiàn)兩種不同的形式:一種是囊上皮細(xì)胞的扁平葉瓣,排列成疊瓦狀,形成瓣膜樣連接,平行的囊上皮葉瓣之間,寬處可達1μm;另一種是囊上皮細(xì)胞排列成單層,有些相鄰的囊上皮細(xì)胞,其游離緣之間相互分離,形成直徑約2.5μm的囊上皮孔。 2 DMSO冷凍割斷法SEM觀察 SEM觀察顯示,在大鼠松果體的割斷面上,相鄰的松果體細(xì)胞膜相對面凹陷,形成許多細(xì)胞間小管,寬闊的血管周(圍結(jié)締組織間)隙清晰可辨,細(xì)胞間小管與血管周隙相互交通。 3 SEM觀察 松果體囊表面SEM觀察顯示,囊上皮細(xì)胞之間存在篩狀和喇叭口狀上皮孔。篩狀上皮孔主要存在于1.5月齡大鼠的松果體囊,是由上皮細(xì)胞周邊部的胞質(zhì)突起,相互交織形成的圓形孔洞,直徑約200~500nm;喇叭口狀上皮孔見于1.5月齡和12月齡大鼠的松果體囊,是由相鄰上皮細(xì)胞向松果體內(nèi)部凹陷,形成圓形或橢圓形孔洞,孔徑約1~4μm。在大鼠松果體囊表面,還可見到直徑0.5~1μm的球形顆粒、膜殼和胞膜碎片,偶見圓形和多突起的巨噬樣細(xì)胞。 結(jié)論:松果體細(xì)胞表面,可分為結(jié)締組織間隙面、連接面和細(xì)胞間小管面三個功能面;相臨的松果體細(xì)胞之間,局部細(xì)胞膜凹陷,形成互相連通的細(xì)胞間小管。大鼠松果體細(xì)胞分泌顆粒的釋放形式,可能存在連同顆粒被膜的整體釋放。松果體分泌物可通過結(jié)締組織間隙面,釋放入血管周隙;或通過細(xì)胞間小管面,釋放入細(xì)胞間小管內(nèi)。釋放到松果體組織液中的分泌顆粒,可能通過血管周隙—細(xì)胞間小管—松果體囊結(jié)締組織間隙—囊上皮瓣膜樣連接或囊上皮孔,直接進入蛛網(wǎng)膜下隙的腦脊液中。由于滲透壓等理化性質(zhì)的改變,分泌顆粒膨脹,部分顆粒被膜破裂,釋放出松果體激素微粒,隨腦脊液轉(zhuǎn)運和發(fā)揮作用。
[Abstract]:Therefore , it is believed that the release form of the peptide hormone secretion particles can be released directly into the cerebrospinal fluid of the third ventricle or the subarachnoid space .






Establishment of primary culture system of rat pinealocytes






Objective : To establish an in vitro cultured rat pinealbody cell line , to observe the changes of the growth , proliferation and functional state of the cultured pine nut cells , and to explore the optimal growth and functional status of the cultured pine nut cells , and to reveal the influence of the factors such as nerve and body fluid on the pinealbody , and to reveal the synthesis and secretion of peptide hormones in the pine body cells , and provide experimental research basis .






Methods : After disinfection of 75 % ethanol , the cells were cultured in DMEM / F12 medium containing 10 % fresh bovine serum , penicillin 100IU / ml and streptomycin 100IU / ml . The cells were cultured in DMEM / F12 medium containing 10 % fresh bovine serum , penicillin 100IU / ml and streptomycin 100IU / ml .






Results : After 6 hours of inoculation , the cells were cultured and the cells were cultured for 4 days .






Conclusion : The culture system of rat pinealocytes in vitro is established , and the method is simple and easy to implement , so the price is low and factory - direct.We even have the best time to observe the growth of rat pinealocytes in the middle and middle of the fiber - like cell layer .






Observation on the immunoreactive cells and fibers of somatostatin immunoreactive cells in the pinealbodies of rats






The aim of this study is to investigate whether or not to synthesize and secrete somatostatin - like inhibitory hormones .






Method :






Immunocytochemical observation of somatostatin in pine body






Sprague - Dawley rats aged 15 days were perfused with 0.9 % warm physiological saline at 9 : 00 - 11 : 00 a.m . in the spring , and then perfused with 4 % polyformaldehyde at 4 鈩，

本文編號：1860485