本文選題：流感病毒 + 血凝素　； 參考：《四川大學(xué)》2007年碩士論文

【摘要】： 目的 甲型流感病毒曾在世界上多次發(fā)生大規(guī)模的流感暴發(fā)流行，目前對(duì)流感尚無(wú)特效藥物進(jìn)行治療，接種流感疫苗是易感者預(yù)防流感的最佳選擇，核酸疫苗是當(dāng)前流感疫苗研究的方向與熱點(diǎn)。流感病毒血凝素(hemagglutinin，HA)是流感病毒的主要保護(hù)性抗原，能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和性抗體，此類(lèi)抗體具有中和病毒和防止病毒進(jìn)入靶細(xì)胞的作用，可中斷病毒的復(fù)制。HA由HA1重鏈和HA2輕鏈相連構(gòu)成。HA的5個(gè)抗原決定簇主要都位于HA1區(qū)，因而流感亞單位疫苗的靶標(biāo)就首選HA1區(qū)。小鼠β-防御素2(mBD2)是一種內(nèi)源性的抗菌肽，對(duì)非成熟的DC細(xì)胞具有趨化作用，能活化APC，，增強(qiáng)機(jī)體的免疫作用，因此可以作為一種天然的免疫佐劑。 本研究的目的在于構(gòu)建mBD2與HA1融合的真核表達(dá)載體(pcDNA3.1(+)／mBD2-HA1)，并檢測(cè)其在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)，觀察pcDNA3.1(+)／mBD2-HA1免疫小鼠后對(duì)流感病毒攻擊的保護(hù)力，研究mBD2作為免疫佐劑的可行性。 方法 用PCR技術(shù)分別從構(gòu)建好的質(zhì)粒pcDNA3.1(+)／mBD2和pcDNA3.1(+)／HA1中擴(kuò)增出mBD2與HA1基因片段，再用重疊延伸PCR法(overlap-PCR)將mBD2與HA1通過(guò)一段柔性多肽接頭Gly_4Ser融合為mBD2—HA1。將mBD2—HA1融合基因插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E. coli JM109并篩選陽(yáng)性克隆。經(jīng)酶切、PCR和測(cè)序鑒定正確后，用脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)／mBD2-HA1轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，用課題組制備的兔抗流感病毒血清作為一抗，F(xiàn)ITC熒光素標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗，通過(guò)免疫熒光檢測(cè)融合蛋白的真核表達(dá)情況。為了研究重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)／mBD2-HA1對(duì)甲型流感病毒的免疫保護(hù)作用，我們以SPF級(jí)BALB／c小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，用pcDNA3.1(+)／mBD2-HA1、pcDNA3.1(+)／HA1和pcDNA3.1(+)質(zhì)粒DNA分別免疫小鼠，一共免疫兩次，每次間隔三周。在第二次加強(qiáng)免疫前，用斷尾法從小鼠尾部取血；第二次免疫后10d(病毒攻擊后3d)，再次取血，并收集血清檢測(cè)抗-HA抗體。加強(qiáng)免疫后一周，用致死量(10×LD50)滴鼻攻擊小鼠，觀測(cè)動(dòng)物的體重變化及存活率。綜合以上幾個(gè)方面評(píng)價(jià)重組質(zhì)粒的免疫保護(hù)效果。 結(jié)果 PCR法分別從質(zhì)粒pcDNA3.1(+)／mBD2和pcDNA3.1(+)／HA1中擴(kuò)增出了mBD2與HA1基因片段，并且用重疊延伸PCR法成功將mBD2與HA1通過(guò)一段柔性多肽接頭Gly_4Ser融合為mBD2-HA1。重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)／mBD2-HA1經(jīng)雙酶切電泳后出現(xiàn)大小約1.2kb的目的條帶，PCR鑒定也出現(xiàn)了相同大小的條帶，目的片段經(jīng)測(cè)序和將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast比對(duì)，證實(shí)了克隆片段是正確的。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果表明重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)／mBD2-HA1體外實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛟贖EK293細(xì)胞中表達(dá)mBD2-HA1的融合蛋白。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，pcDNA3.1(+)空質(zhì)粒對(duì)照組的小鼠7d內(nèi)全部死亡，pcDNA3.1(+)／HA1免疫組的小鼠保護(hù)率為50％，而pcDNA3.1(+)／mBD2-HA1組的小鼠保護(hù)率為90％；與單獨(dú)免疫pcDNA3.1(+)／HA1相比，mBD2-HA1融合基因DNA免疫小鼠后，誘導(dǎo)出了更高的抗-HA抗體，保護(hù)率也更高，并且體重丟失明顯減少。 結(jié)論 綜上所述，本研究成功構(gòu)建了mBD2—HA1融合基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)／mBD2-HA1，該質(zhì)粒能在真核細(xì)胞中表達(dá)融合蛋白；經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，pcDNA3.1(+)／mBD2-HA1重組質(zhì)粒DNA免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后，能夠?yàn)榭沽鞲胁《竟籼峁┖芎玫谋Ｗo(hù)力，其保護(hù)效果明顯高于pcDNA3.1(+)／HA1免疫組。本研究結(jié)果初步表明：小鼠β防御素2可以作為一種免疫佐劑用于流感病毒的DNA疫苗中。
[Abstract]:Purpose





Influenza A virus ( HA ) is the main protective antigen of influenza virus , which is the main protective antigen of influenza virus , which can stimulate organism to produce neutralizing antibody . The HA is composed of HA1 heavy chain and HA2 light chain .





The aim of this study was to construct the eukaryotic expression vector ( pcDNA3.1 ( + ) / mBD2 - HA1 ) fused with mBD2 and HA1 , and to detect the expression of pcDNA3.1 ( + ) / mBD2 - HA1 , and to observe the protective effect of pcDNA3.1 ( + ) / mBD2 - HA1 on influenza virus attack , and to study the feasibility of mBD2 as an adjuvant .





method





The recombinant plasmid pcDNA3.1 ( + ) / mBD2 - HA1 was inserted into eukaryotic expression vector pcDNA3.1 ( + ) . The recombinant plasmid pcDNA3.1 ( + ) / mBD2 - HA1 was inserted into eukaryotic expression vector pcDNA3.1 ( + ) .
After 10 days after the second immunization ( 3 days after the challenge of the virus ) , the blood was taken again and the anti - HA antibody was collected . One week after immunization , the mice were challenged with lethal dose ( 10 脳 LD50 ) to observe the weight change and survival rate of the animals . The immune protective effect of the recombinant plasmid was evaluated in the above aspects .





Results





mBD2 and HA1 were amplified from pcDNA3.1 ( + ) / mBD2 and pcDNA3.1 ( + ) / HA1 by PCR , and mBD2 and HA1 were fused to mBD2 - HA1 by overlapping extension PCR . The recombinant plasmid pcDNA3.1 ( + ) / mBD2 - HA1 was subjected to blast - specific electrophoresis . The results showed that the recombinant plasmid pcDNA3.1 ( + ) / mBD2 - HA1 was able to express mBD2 - HA1 in vitro . The results showed that the protective rate of pcDNA3.1 ( + ) / mBD2 - HA1 was 50 % , while the protective rate of pcDNA3.1 ( + ) / mBD2 - HA1 was 90 % .
Compared with pcDNA3.1 ( + ) / HA1 alone , mBD2 - HA1 fusion gene DNA immunized mice induced higher anti - HA antibody , higher protection rate , and decreased body weight loss .





Conclusion





In conclusion , the eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1 ( + ) / mBD2 - HA1 of mBD2 - HA1 fusion gene was successfully constructed .
The protective effect of pcDNA3.1 ( + ) / mBD2 - HA1 was significantly higher than that of pcDNA3.1 ( + ) / HA1 .

【學(xué)位授予單位】：四川大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類(lèi)號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1852966