本文選題：乙型肝炎病毒 + 人免疫缺陷病毒�。� 參考：《復(fù)旦大學(xué)》2007年博士論文

【摘要】： 乙型肝炎病毒聚合酶新功能區(qū)的發(fā)現(xiàn)和意義研究 乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染在全球超過3億人。HBV屬于嗜肝DNA病毒科，該科具有部分雙鏈環(huán)狀的DNA基因組。HBV通過特有的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)進行復(fù)制。HBV編碼的聚合酶／逆轉(zhuǎn)錄酶(Reverse transcriptase，RT)的結(jié)構(gòu)和功能在其復(fù)制過程中起重要作用。但是，至今具有酶活性的HBV RT仍不能足量表達用于體外生化研究和晶體學(xué)分析。此外，也沒有合適的體外感染系統(tǒng)用于分析復(fù)雜的HBV復(fù)制周期。通過對分離自乙肝病人的兩株B基因型HBV的全基因組克隆和基于細胞轉(zhuǎn)染的復(fù)制效率測定，我們曾報道HBV RT第306位脯氨酸(rtP306)置換為絲氨酸或其他氨基酸時，大部分變異體的復(fù)制效率下降。為闡明這些變異體復(fù)制效率下降的機理，我們首先構(gòu)建一C基因型毒株的rtP306變異體并轉(zhuǎn)染Huh-7細胞，然后比較變異體與原毒株的復(fù)制能力、轉(zhuǎn)錄水平和pgRNA包裝效率。通過基于細胞轉(zhuǎn)染的復(fù)制效率測定發(fā)現(xiàn)rtP306變異體復(fù)制效率下降，而且RT變異體與RT缺失復(fù)制子rtW58~*的反式補充實驗也證實這一現(xiàn)象。 為深入了解復(fù)制效率下降的機理，首先分析變異體和原毒株的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示各rtP306變異體具有相似的轉(zhuǎn)錄水平。而且Western印跡顯示rtP306氨基酸置換并不影響RT穩(wěn)定性。我們通過特異性的pgRNA包裝實驗和內(nèi)源性聚合酶反應(yīng)分析HBV RT的兩大主要功能：參與pgRNA包裝和催化核苷轉(zhuǎn)移合成子代病毒DNA。pgRNA包裝效率用細胞內(nèi)衣殼顆粒量校正后的衣殼顆粒內(nèi)pgRNA量表示，細胞內(nèi)衣殼顆粒用抗衣殼蛋白抗體進行Western印跡測定。包裝實驗結(jié)果顯示大部分rtP306變異體的pgRNA包裝效率下降。這一結(jié)果也被內(nèi)源性聚合酶反應(yīng)所確認。同時，通過內(nèi)源性聚合酶反應(yīng)發(fā)現(xiàn)一些rtP306氨基酸置換導(dǎo)致RT核苷轉(zhuǎn)移酶活性下降。 基于上述發(fā)現(xiàn)，我們推測除了rtP306外，rtP306附近的氨基酸(rt304-311)對HBV復(fù)制同樣重要。通過將rt304-311位氨基酸置換為丙氨酸或苯丙氨酸構(gòu)建變異體并測定其復(fù)制效率，我們發(fā)現(xiàn)rt304-311置換確實導(dǎo)致HBV復(fù)制效率明顯下降。相關(guān)機理不是轉(zhuǎn)錄水平或RT穩(wěn)定性改變而是pgRNA包裝效率下降。作為對照，遠離rtP306的氨基酸(rt336和rt346)置換不影響病毒復(fù)制效率。據(jù)我們所知，這是首次報道rt304-311氨基酸保守在pgRNA包裝中起重要作用。此外，與原毒株相比，rtY305A變異體對抗病毒藥阿德福韋的敏感性下降。阿德福韋據(jù)報道作用于HBV RT“手掌”域的酶活性中心，而rtY305置換位于HBV RT“拇指”域，因此藥敏實驗提示rt304-311氨基酸置換可能改變HBV RT構(gòu)型從而導(dǎo)致與抗病毒藥的親和力下降。 此外，通過生物信息學(xué)方法分析rt304-311對HBV RT和HBV復(fù)制的作用，結(jié)果顯示：1)預(yù)測rt304-311位于HBV RT“拇指”域一螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)角上，這一螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)稱為螺旋鉗基序；2)轉(zhuǎn)角氨基酸在已報導(dǎo)的基因型A-H毒株中非常保守；3)部分HBV RT轉(zhuǎn)角氨基酸在逆轉(zhuǎn)錄病毒RT和丙型肝炎病毒RNA依賴的RNA聚合酶的螺旋鉗基序中保守。螺旋鉗基序是真核生物、細菌和病毒的核酸聚合酶拇指域中一共同的結(jié)構(gòu)元件，在聚合反應(yīng)時可結(jié)合核酸模板和引物。因此，我們通過生物學(xué)和結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)方法確認了HBV RT螺旋鉗基序轉(zhuǎn)角(rt304-311)，該轉(zhuǎn)角作為一新功能區(qū)可能通過控制HBV RT與核酸的親和力來調(diào)節(jié)HBV pgRNA包裝效率。 人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)是逆轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬的研究模型。與HBV相似，HIV也通過特有的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)進行復(fù)制。為研究HIV RT螺旋鉗基序轉(zhuǎn)角是否在HIV復(fù)制中起重要作用，以一HIV前病毒質(zhì)�；A(chǔ)上將HIV RT轉(zhuǎn)角置換為丙氨酸。通過單周期感染實驗檢測各變異體的復(fù)制能力。初步結(jié)果顯示HIV-1轉(zhuǎn)角變異體(rtY271A和rtl274A)不能在Jurkat細胞內(nèi)復(fù)制。而且，HIV-1 RT轉(zhuǎn)角變異體(rtY271A和rtl274A)與DNA模板／引物結(jié)合能力下降�？傊�，HBV RT和HIV RT螺旋鉗基序轉(zhuǎn)角在病毒復(fù)制過程中起重要作用并且可以作為抗病毒藥物設(shè)計的新靶點。 目前，已注冊的抗HBV藥物如拉米呋啶，阿德福韋酯和恩替卡韋都是作用在HBV RT催化中心的核苷(酸)類似物。長期使用這些藥物將導(dǎo)致耐藥株的出現(xiàn)。因此迫切需要發(fā)展新的抗HBV藥物。在篩選針對HBV RT和HIV RT螺旋鉗基序轉(zhuǎn)角的化合物時，我們發(fā)現(xiàn)一種非核苷類似物KM-1，2-萘磺酸，4-羥基-7-[[[[5-羥基—6-[(4-肉桂酸苯基)偶氮]-7-磺酸-2-萘基]氨基]羰基]氨基]-3-[(4-肉桂酸苯基)]偶氮(2-naphthalenesulfonic acid，(4-hydroxy-7-[[[[5-hydroxy-6-[(4-cinnamylphenyl)azo]-7-sulfo-2-naphthalenyl]amino]carbonyl]amino]-3-[(4-cinnamylphenyl)]azo))曾被報道通過與已知非核苷類似物不同的機制有效地抑制HIV RT。而且，據(jù)推測，，KM-1針對HIV RT的“拇指”域。因此，我們采用多種方法評價KM-1的抗HBV活性。通過內(nèi)源性聚合酶反應(yīng)發(fā)現(xiàn)KM-1抑制野生型HBV RT及其對三磷酸拉米呋啶耐藥的變異體rtL180M／M2041，50％抑制濃度分別為2.6μM和0.5μM，因此KM-1通過與三磷酸拉米呋啶不同的機制抑制HBV RT。通過基于細胞轉(zhuǎn)染的復(fù)制效率測定發(fā)現(xiàn)KM-1抑制野生型HBV及其變異體rtL180M／M2041在細胞內(nèi)復(fù)制，50％抑制濃度分別為31.2μM和9.5μM。此外，KM-1有一定細胞毒性，50％細胞毒濃度為105μM。因此，設(shè)計能與RT拇指區(qū)甚至拇指區(qū)螺旋鉗基序轉(zhuǎn)角結(jié)合的新化合物有望發(fā)展成新的抗HBV或抗HIV藥物。
[Abstract]:Discovery and significance of new functional region of hepatitis B virus polymerase
Hepatitis B virus (Hepatitis B virus, HBV) infection in more than 300 million people all over the world.HBV belongs to the liver DNA family, the family has a partial double chain ring DNA genome.HBV that replicates the structure and function of the.HBV encoded polymerase / reverse transcriptase (Reverse transcriptase, RT) in its replication process. However, the HBV RT with enzyme activity still cannot be expressed enough for biochemical and crystallographic analysis in vitro. In addition, there is no suitable external infection system for analyzing complex HBV replication cycles. Complete genome cloning of two B genotype HBV isolated from hepatitis B patients and the replication efficiency based on cell transfection Rate determination, we reported that when HBV RT 306th bits of proline (rtP306) was replaced by serine or other amino acids, the replication efficiency of most of the variants decreased. In order to clarify the mechanism of the decrease in the replication efficiency of these variants, we first constructed a rtP306 variant of a C genotype and transfected Huh-7 cells, and then compared the variant and the original strain. Replication ability, transcriptional level and pgRNA packaging efficiency. The replication efficiency of rtP306 variants was detected by cell transfection based replication efficiency, and a trans supplemental experiment with RT variant and RT deletion replicon rtW58~* also confirmed this phenomenon.
In order to understand the mechanism of replication efficiency decline, the transcriptional level of the variant and the original strain was analyzed. The results showed that the rtP306 variants had similar transcriptional levels. And the Western blot showed that the rtP306 amino acid replacement did not affect the stability of RT. We analyzed HBV R by specific pgRNA packaging experiments and endogenous polymerase chain reaction. The two main functions of T: participation in pgRNA packaging and catalytic nucleoside transfer synthesis of subgeneration virus DNA.pgRNA packaging efficiency using the pgRNA quantity in the capsid particles adjusted by the cell lingerie shell particle size, and the cell lingerie shell particles using the anti capsid protein antibody for Western imprinting. The packaging test results show the pgRNA of most of the rtP306 variants. This result was also confirmed by endogenous polymerase reaction. At the same time, some rtP306 amino acid replacement resulted in the decrease of RT nucleoside transferase activity by endogenous polymerase reaction.
Based on the above findings, we speculate that in addition to rtP306, the amino acid (rt304-311) near rtP306 is equally important for HBV replication. By replacing rt304-311 - based amino acids to alanine or phenylalanine to construct variants and determining their replication efficiency, we found that rt304-311 replacement did lead to a significant decline in the efficiency of HBV replication. The related mechanism is not a turn. Recording level or RT stability change is the decrease in pgRNA packaging efficiency. As a control, the removal of rtP306 amino acids (rt336 and rt346) does not affect viral replication efficiency. To our knowledge, this is the first report that the rt304-311 amino acid conservatism plays an important role in pgRNA packaging. In addition, the rtY305A variant is against the virus drug A De compared to the original strain. The sensitivity of fovir declined. Adefovir was reported to be used as an enzyme activity center in the HBV RT "palm" domain, while rtY305 replacement was located in the HBV RT "thumb" domain, so the drug sensitivity experiment suggested that the rt304-311 amino acid replacement might change the HBV RT configuration and thus lead to a decrease in affinity with the antiviral drugs.
In addition, the effect of rt304-311 on HBV RT and HBV replication is analyzed by bioinformatics. The results show that: 1) the prediction of rt304-311 is located at the corner of a spiral angle spiral structure in the HBV RT "thumb" domain, and this spiral angle spiral structure is called the spiral forceps, and 2) the angular amino acids are very guaranteed in the reported genotype A-H strain. Guard; 3) partial HBV RT corner amino acids are conserved in the spiral forceps of retrovirus RT and RNA polymerase of hepatitis C virus RNA dependent. The spiral forceps are a common structural element in the nucleic acid polymerase of the eukaryotic, bacterial and viral nucleic acid polymerase in the thumb domain, which can be combined with nucleic acid templates and primers during polymerization. Biological and structural bioinformatics methods confirm the HBV RT spiral forceps base sequence angle (rt304-311), which may regulate the HBV pgRNA packaging efficiency by controlling the affinity of HBV RT with the nucleic acid as a new functional area.
Human immunodeficiency virus (HIV) is a study model of the genus lentivirus in the retroviral family. Similar to HBV, HIV also replicates through specific reverse transcriptase. To study whether the HIV RT spiral forceps base sequence angle plays an important role in HIV replication, and the HIV RT transfer angle is replaced by a HIV virus plasmid. The replication ability of various variants was detected by a single cycle infection test. Preliminary results showed that HIV-1 angle variants (rtY271A and rtl274A) could not be replicated in Jurkat cells. Moreover, the binding ability of HIV-1 RT angle variants (rtY271A and rtl274A) to DNA template / primers decreased. In a word, HBV RT and HIV spiral forceps were in the virus. Replication plays an important role and can be used as a new target for antiviral drug design.
Currently, registered anti HBV drugs such as lamamoxurin, adefovir and entecavir are all nucleoside (acid) analogues that act at the HBV RT catalytic center. Long term use of these drugs will lead to the emergence of resistant strains. Therefore, the development of new anti HBV drugs is urgently needed. When screening compounds for HBV RT and HIV RT spiral forceps, I We found a non nucleoside analogue, KM-1,2- naphthalene sulfonic acid, 4- hydroxyl -7-[[[[5- hydroxyl 6-[(4- cinnamic acid phenyl) azo]-7- sulfonic acid -2- naphthyl] carbonyl] amino]-3-[(4- cinnamate phenyl)] AZO (2-Naphthalenesulfonic acid, 4-hydroxy-7-[[[[5-hydroxy-6-[) ]-3-[(4-cinnamylphenyl)]azo)) has been reported to effectively inhibit HIV RT. through a mechanism different from the known non nucleoside analogues and it is presumed that KM-1 is directed to the "thumb" domain of HIV RT. Therefore, we have used a variety of methods to evaluate the anti HBV activity of KM-1. The KM-1 inhibitory wild type HBV, and its three phosphoric acid, were found by the endogenous polymerized enzyme reaction. The inhibitory concentrations of lamifuridine resistant variants rtL180M / M2041,50% were 2.6 mu M and 0.5 M respectively. Therefore, KM-1 inhibited HBV RT. by inhibiting the replication efficiency based on cell transfection by the different mechanisms of lamifuridine phosphate three, and found that KM-1 inhibited wild type HBV and its variant rtL180M / M2041 in cell replication and 50% inhibition concentration. In addition to 31.2 M and 9.5 mu M., KM-1 has a certain cytotoxicity and the concentration of 50% cells is 105 M., so a new compound designed to combine with the RT thumb region and even the spiral forceps of the thumb area is expected to develop into a new anti HBV or anti HIV drug.

【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R373

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本文編號：1852780