本文選題：梅毒螺旋體 + 外膜蛋白��； 參考：《南華大學(xué)》2005年碩士論文

【摘要】：目的:篩選比較梅毒螺旋體(Treponema pallidum,Tp)各外膜蛋白的抗原性和同源性,分別構(gòu)建真核表達(dá)重組體pcDNA3.1(+)-Gpd、pcDNA3.1(+)-Tp92和雙基因融合表達(dá)重組體pcDNA3.1(+)-Gpd-Tp92,檢測(cè)其所誘導(dǎo)產(chǎn)生的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平,比較單基因核酸疫苗和雙基因融合核酸疫苗的免疫效果,為研制高效、新型的Tp核酸疫苗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法:用PCGENE軟件分析Tp外膜蛋白Gpd和Tp92基因序列,設(shè)計(jì)相應(yīng)特異性引物,PCR分別擴(kuò)增上述兩基因1059bp和2103bp的目的基因片段,將其插入pUCm-T載體,通過(guò)藍(lán)白斑初篩,酶切分析、PCR及測(cè)序鑒定篩選陽(yáng)性重組體;將Gpd和Tp92基因亞克隆至真核表達(dá)載體構(gòu)建pcDNA3.1(+)-Gpd、pcDNA3.1(+)-Tp92和pcDNA3.1(+)-Gpd-Tp92重組體,并分別轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,用免疫細(xì)胞化學(xué)及western blot鑒定其在真核細(xì)胞的表達(dá);分別在0、2、4、8w將核酸疫苗pcDNA3.1(+)-Gpd、pcDNA3.1(+)-Tp92、pcDNA3.1(+)-Gpd-Tp92及對(duì)照空質(zhì)粒pcDNA3.1(+)分組注射于新西蘭兔后腿股四頭肌,每次劑量為100/μg,末次免疫后2w,無(wú)菌分離兔脾細(xì)胞,經(jīng)特異性重組蛋白抗原刺激后,ELISA雙抗體夾心法測(cè)定培養(yǎng)上清中IFN-γ水平,ELISA間接法測(cè)定新西蘭兔血清中抗Gpd和抗Tp92特異性抗體水平;MTT法、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)測(cè)定脾淋巴細(xì)胞特異性增殖反應(yīng)。 結(jié)果: 成功構(gòu)建了pcDNA3.1(+)-Gpd和pcDNA3.1(+)-Tp92單基因真核表達(dá)載體
[Abstract]:Objective: to screen and compare the antigenicity and homology of the outer membrane proteins of Treponema pallidum TpP of Treponema pallidum. The eukaryotic expression recombinant pcDNA3.1 was constructed, and the recombinant pcDNA3.1was constructed respectively. The humoral and cellular immune responses induced by the recombinant plasmid pcDNA3.1and the double gene fusion recombinant pcDNA3.1were detected, and the immune effects of single-gene nucleic acid vaccine and double-gene fusion nucleic acid vaccine were compared. To provide experimental basis for the development of high-efficiency and novel TP nucleic acid vaccine. Methods: the Gpd and Tp92 gene sequences of TP outer membrane protein were analyzed by PCGENE software. Specific primers were designed to amplify the target gene fragments of 1059bp and 2103bp, respectively. The fragments were inserted into pUCm-T vector and screened by blue and white spot. Gpd and Tp92 genes were subcloned into eukaryotic expression vector to construct pcDNA3.1 (Tp92 and pcDNA3.1) and transfected into HeLa cells respectively, and their expression in eukaryotic cells was identified by immunocytochemistry and western blot. The nucleic acid vaccine pcDNA3.1 was injected into the quadriceps femoris hind leg of New Zealand rabbits at a dose of 100 / 渭 g at each dose of 100 / 渭 g at 8 weeks after the last immunization, and the splenocytes were isolated from rabbits by sterility 2 weeks after the last immunization, and the control plasmid pcDNA3.1was injected into the hind leg quadriceps of New Zealand rabbits, respectively, and the control plasmid pcDNA3.1was injected into the hind leg quadriceps of New Zealand rabbits at a dose of 100 / 渭 g each time, and the spleen cells were isolated from rabbits two weeks after the last immunization. The level of IFN- 緯 in culture supernatant was determined by Elisa double antibody sandwich method after stimulation with specific recombinant protein antigen. Indirect Elisa was used to detect the level of anti Gpd and anti Tp92 specific antibody in New Zealand rabbit serum. Lymphocyte transformation test was used to determine the specific proliferation of splenic lymphocytes. Results: The eukaryotic expression vectors of pcDNA3.1 (Gpd) and pcDNA3.1 (Tp92) were successfully constructed.
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：1831821