本文選題：人/鼠嵌合四聚體 + HBV/HLA-A2.1雙轉(zhuǎn)基因小鼠　； 參考：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2007年碩士論文

【摘要】： 通常MHC I類四聚體被用于定量分析表位特異的CD8+T細(xì)胞。MHC I類四聚體是由4個(gè)MHC I類復(fù)合物和一個(gè)帶有熒光標(biāo)的親和素分子組成的。其中每個(gè)MHC I類復(fù)合物是由分別表達(dá)、純化的MHC分子的重鏈和β2微球蛋白與合成的表位肽在折疊緩沖液中共折疊所形成的。這種方法勢必會形成較多的多聚物和自身折疊產(chǎn)物,而且同時(shí)純化兩種單體是很費(fèi)時(shí)的。為了解決這些問題,在本研究中,我們將串聯(lián)設(shè)計(jì)的人/鼠嵌合MHC分子的重鏈(HLA-A2α1, HLA-A2α2,MHC-H2Dα3)與β2微球蛋白克隆到pET17b載體上,并表達(dá)為融合蛋白。將重組的融合蛋白與HLA-A2限制性表位肽兩者共折疊形成人/鼠嵌合MHC I類復(fù)合物。這樣就會提高產(chǎn)量,也可以節(jié)省大量時(shí)間。此外,我們還采用了凝膠遲滯的方法來檢測人/鼠嵌合MHC I類復(fù)合物生物素化的效率。我們將最終形成的人/鼠嵌合四聚體用于體外定量檢測HLA-A2轉(zhuǎn)基因鼠上所產(chǎn)生的HLA-A2限制性細(xì)胞免疫水平。 由于缺少合適的動(dòng)物模型,在體內(nèi)對人乙肝疫苗免疫原性的臨床前評價(jià)一直受到了制約。在本項(xiàng)研究中,我們構(gòu)建了能夠同時(shí)表達(dá)HBV和HLA兩種基因的HBV/HLA-A2.1雙轉(zhuǎn)基因小鼠。此雙轉(zhuǎn)基因鼠不僅表現(xiàn)出對HBV各種抗原的耐受,而且能夠有效地遞呈HLA-A2限制性的抗原表位。我們用HLA-A2限制性HBc或HBs的表位疫苗免疫此雙轉(zhuǎn)基因小鼠,借助CTL實(shí)驗(yàn)、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)和四聚體染色的手段證明其能夠被有效的誘導(dǎo)出針對HLA-A2限制性HBc和HBs特異性的免疫應(yīng)答。 總之,我們構(gòu)建的有生物活性的人/鼠嵌合四聚體以及HBV/HLA-A2.1雙轉(zhuǎn)基因鼠國內(nèi)外均未見報(bào)道。人/鼠嵌合四聚體能恰當(dāng)?shù)亩糠从矵LA-A2限制性細(xì)胞免疫水平。同時(shí),HBV/HLA-A2.1雙轉(zhuǎn)基因小鼠能夠在多方面評價(jià)人乙肝疫苗的免疫原性:抗體的產(chǎn)生、γ干擾素的分泌水平、免疫小鼠的特異性CTL活性和有效降低體內(nèi)抗原水平。這些結(jié)果也證明了HBV/HLA-A2.1雙轉(zhuǎn)基因小鼠作為評價(jià)人乙肝病毒疫苗免疫原性動(dòng)物模型的可用性。
[Abstract]:In general, MHC I tetramer is used to quantitatively analyze epitope specific CD8 T cells. MHCI tetramer is composed of four MHC I complexes and a fluorescent target affinity molecule. Each MHC class I complex is formed by co-folding the heavy chain and 尾 2 microglobulin of the purified MHC molecule with the synthesized epitope peptide in the folding buffer solution. This method is bound to form more polymers and self-folding products, and it takes time to purify the two monomers simultaneously. In order to solve these problems, we cloned HLA-A2 偽 1, HLA-A2 偽 2 MHC-H2D 偽 3 and 尾 2 microglobulin of human / mouse chimeric MHC molecule designed in tandem into pET17b vector and expressed as fusion protein. The recombinant fusion protein was co-folded with HLA-A2 restriction epitope peptide to form a human / mouse chimeric MHC class I complex. This will increase production and save a lot of time. In addition, we also used the gel hysteresis method to detect the biotin efficiency of human / mouse chimeric MHC class I complex. The resulting human / mouse chimeric tetramer was used to quantitatively detect the HLA-A2 restricted cellular immunity in HLA-A2 transgenic mice in vitro. Due to the lack of suitable animal models, preclinical evaluation of the immunogenicity of human hepatitis B vaccine has been restricted in vivo. In this study, we constructed HBV/HLA-A2.1 double transgenic mice which could express both HBV and HLA genes. The two transgenic mice not only showed tolerance to various antigens of HBV, but also presented HLA-A2 restricted epitopes effectively. We immunized the double transgenic mice with epitope vaccines of HLA-A2 restricted HBc or HBs, and we used CTL experiment. Enzyme linked immunoblot assay (Elisa) and tetramer staining showed that it could effectively induce a specific immune response to HLA-A2 restricted HBc and HBs. In a word, the bioactive human / mouse chimeric tetramer and HBV/HLA-A2.1 double transgenic mice have not been reported at home and abroad. Human / mouse chimeric tetramer is an appropriate quantitative reflection of HLA-A2 restricted cellular immunity. At the same time, HBV / HLA-A2.1 transgenic mice could evaluate the immunogenicity of human hepatitis B vaccine in many ways: the production of antibody, the secretion level of interferon 緯, the specific CTL activity of immunized mice and the effective reduction of antigen level in vivo. These results also demonstrate the availability of HBV/HLA-A2.1 double transgenic mice as an animal model for evaluating the immunogenicity of human hepatitis B vaccine.
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R392

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本文編號：1790851