本文選題：臍血 + 間充質(zhì)干細(xì)胞��； 參考：《山西醫(yī)科大學(xué)》2007年碩士論文

【摘要】： 目的:探討人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)體外分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞的條件;觀察誘導(dǎo)后的MSCs源性神經(jīng)細(xì)胞移植對大鼠脊髓損傷的治療效果,為治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷提供實(shí)用的細(xì)胞來源。 方法:1.體外分離、純化、擴(kuò)增臍血MSCs:采用Ficoll分離法分離臍血單個核細(xì)胞(mononuclear cells,MNCs),并以低糖DMEM(含10%FBS)培養(yǎng)基接種于6孔培養(yǎng)板中,胰酶消化傳代。取傳三代的細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面分子CD11b、CD34、CD45和CD44的表達(dá)。2.臍血MSCs的誘導(dǎo)分化:采用腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF 10ng/ml+維甲酸RA 0.5μM+堿性成纖維生長因子bFGF 20ng/ml協(xié)同誘導(dǎo)培養(yǎng)三代的臍血MSCs定向分化。誘導(dǎo)7d后,用免疫熒光染色法檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞特異標(biāo)志GFAP及神經(jīng)元特異標(biāo)志MAP2的表達(dá)情況。3.體內(nèi)實(shí)驗(yàn):采用橫切法制備大鼠脊髓橫斷損傷模型,實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為三組:PBS組、細(xì)胞移植組、單純手術(shù)組,每組10只。損傷術(shù)后48h,分別于損傷部位注入等量的PBS、Brdu標(biāo)記的誘導(dǎo)后的細(xì)胞,單純手術(shù)組損傷后不施加任何干預(yù)作為對照。采用BBB運(yùn)動功能評分標(biāo)準(zhǔn)在移植術(shù)后24h及1、2、3、4、5w各時間點(diǎn)對大鼠進(jìn)行運(yùn)動功能評分。用組織學(xué)和免疫組化方法檢測移植到大鼠脊髓中的Brdu陽性細(xì)胞的存活、遷移情況。 結(jié)果:臍血MSCs體外培養(yǎng)三代后,細(xì)胞表面CD11b、CD34、CD45、CD44表達(dá)陰性。誘導(dǎo)分化7d后,大部分細(xì)胞的形態(tài)類似神經(jīng)元,免疫熒光染色檢測MAP2陽性細(xì)胞占大多數(shù),明顯多于GFAP陽性細(xì)胞。移植后2～5w,細(xì)胞移植組大鼠的后肢運(yùn)動功能恢復(fù)情況均好于PBS組和單純手術(shù)組(P＜0.05)。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示植入的細(xì)胞可長時間在宿主脊髓中存活,并向損傷處兩端遷移。 結(jié)論:人臍血MSCs于體外在特定的條件下可以誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞為主體的神經(jīng)細(xì)胞。移植臍血MSCs誘導(dǎo)后的神經(jīng)細(xì)胞可在損傷的宿主脊髓中存活、遷移,并能促進(jìn)脊髓損傷后行為和功能恢復(fù)。
[Abstract]:Objective: to investigate the conditions for the isolation, culture and differentiation of mesenchymal stem cells from human umbilical cord blood into neural cells in vitro, and to observe the therapeutic effects of induced MSCs derived neural cell transplantation on spinal cord injury in rats. To provide a useful source of cells for the treatment of central nervous system injury. Method 1: 1. In vitro isolation, purification and amplification of umbilical cord blood MSCs: mononuclear cells were isolated from cord blood mononuclear cells (MNCs) by Ficoll method, and cultured in 6-well culture plate on low glucose DMEM medium (containing 10s), and the trypsin was digested and subcultured. The expression of CD11bC34-CD45 and CD44 on the surface of the cells was detected by flow cytometry. Differentiation of cord blood MSCs: BDNF 10ng/ml retinoic acid RA 0.5 渭 M basic fibroblast growth factor bFGF 20ng/ml was used to induce MSCs directional differentiation of cord blood in three generations. After 7 days of induction, the expressions of astrocyte-specific marker GFAP and neuron-specific marker MAP2 were detected by immunofluorescence staining. In vivo experiment: the rat model of spinal cord transection was established by crosscutting method. The rats were randomly divided into three groups: PBS group, cell transplantation group, simple operation group, 10 rats in each group. 48 hours after injury, the same amount of PBS- Brdu labeled cells were injected into the injured site, and no intervention was given to the operation group after injury. The motor function score of rats was evaluated by BBB motor function score at 24 hours after transplantation and at 4 minutes and 5 weeks after transplantation. The survival and migration of Brdu positive cells transplanted into the spinal cord of rats were detected by histological and immunohistochemical methods. Results: after three passages of umbilical cord blood MSCs culture in vitro, the expression of CD11bU CD34, CD45 and CD44 was negative on the cell surface. After 7 days of differentiation, the morphology of most cells was similar to that of neurons. Immunofluorescence staining showed that the majority of MAP2 positive cells were more than those of GFAP positive cells. The recovery of hind limb motor function in the cell transplantation group was better than that in the PBS group and the simple operation group (P < 0.05). Immunohistochemical results showed that the implanted cells could survive in the host spinal cord for a long time and migrate to both ends of the injury. Conclusion: human umbilical cord blood MSCs can induce neuronal differentiation into neuron-like cells under specific conditions in vitro. Cord blood MSCs induced nerve cells could survive and migrate in the injured host spinal cord and promote the recovery of behavior and function after spinal cord injury.
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R329

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本文編號：1787168