本文選題：腺病毒載體 + 脂聯(lián)素Acrp30　； 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2007年碩士論文

【摘要】： 第一部分細(xì)菌內(nèi)同源重組制備攜帶脂聯(lián)素Acrp30 siRNA的腺病毒載體 目的細(xì)菌內(nèi)同源重組法構(gòu)建攜帶脂聯(lián)素Acrp30的siRNA腺病毒載體。 方法首先將鼠U6啟動子和脂聯(lián)素Acrp30 siRNA的cDNA克隆入穿梭質(zhì)粒pshuttle,卡那霉素抗性篩選陽性重組子,雙酶切并測序鑒定正確后,將重組子用PmeⅠ線性化后電穿孔入電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BJ5183,與pAdeasy-1在BJ5183內(nèi)同源重組,PacⅠ消化鑒定產(chǎn)生30kb和4.5kb或3.0kb的為陽性重組子,將陽性重組子在超感受態(tài)菌XL10-Gold中擴(kuò)增重組腺病毒質(zhì)粒后,PacⅠ消化,脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞,包裝擴(kuò)增攜帶脂聯(lián)素Acrp30的siRNA重組腺病毒。 結(jié)果成功構(gòu)建脂聯(lián)素Acrp30 siRNA腺病毒載體,測得滴度為4.5×108;3.7×108;5.6×108 PFU/ml。 結(jié)論成功構(gòu)建脂聯(lián)素Acrp30 siRNA腺病毒載體,為下一步脂聯(lián)素Acrp30 siRNA重組腺病毒在脂肪細(xì)胞內(nèi)抑制脂聯(lián)素表達(dá)打下基礎(chǔ)。 第二部分腺病毒載體介導(dǎo)的Acrp30siRNA抑制脂肪細(xì)胞分泌脂聯(lián)素 目的攜帶Acrp30 siRNA的重組腺病毒感染誘導(dǎo)分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞,檢測Acrp30siRNA是否能有效抑制脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素的mRNA和蛋白的表達(dá)。 方法IBMX+胰島素+地塞米松誘導(dǎo)方案誘導(dǎo)分化小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞,用重組腺病毒(MOI100)感染脂肪細(xì)胞并設(shè)RNAi陰性對照,正常對照和空白對照,72h后用ELISA法檢測細(xì)胞上清中脂聯(lián)素蛋白的表達(dá),RT-PCR法檢測脂聯(lián)素mRNA的表達(dá)。 結(jié)果攜帶Acrp30 siRNA的腺病毒載體能在脂肪細(xì)胞中顯著抑制脂聯(lián)素表達(dá)。 結(jié)論構(gòu)建的Acrp30基因特異性siRNA腺病毒載體能有效的抑制脂聯(lián)素在3T3-L1脂肪細(xì)胞中的表達(dá),為進(jìn)一步研究脂聯(lián)素作用機(jī)制提供了新思路。
[Abstract]:Part I preparation of adenovirus vector carrying adiponectin Acrp30 siRNA by homologous recombination in bacteriaObjective to construct siRNA adenovirus vector carrying adiponectin Acrp30 by homologous recombination in bacteria.Methods the mouse U6 promoter and the cDNA of adiponectin Acrp30 siRNA were cloned into the shuttle plasmid pshuttle. kanamycin resistance positive recombinant was screened and identified by double enzyme digestion and sequencing.The recombinant gene was linearized by Pme 鈪，

本文編號：1769558