本文選題：臍帶 + 間充質干細胞　； 參考：《河北醫(yī)科大學》2007年碩士論文

【摘要】： 目的:人臍帶來源的間充質干細胞作為一種新的種子細胞來源越來越受到人們的重視。先前的研究表明從人臍帶組織中分離的間充質干細胞既具有增殖能力,又具有向多細胞(神經元樣細胞、星形膠質細胞、脂肪細胞及少突膠質細胞等)分化的能力,加之來源廣泛、取材容易,在細胞移植、基因治療、組織工程中有廣闊的應用前景。然而,我們在過去四年的研究中體會到從人臍帶分離間充質干細胞并非易事,特別是如何快速、高效的從臍帶中獲得MSC以滿足基礎和未來臨床研究的需要是一個亟待解決的問題。為此,本課題對不同胎齡胎兒臍帶和不同培養(yǎng)方法對分離人臍帶間充質干細胞的影響進行了研究。 方法: 1人臍帶間充質干細胞培養(yǎng):(1)組織貼塊法:分別取足月妊娠剖宮產健康胎兒的臍帶35例及流產胎兒臍帶33例,以PBS充分沖洗,剔除臍帶動、靜脈,將其余的臍帶間質組織切割成直徑約1mm大小的組織塊,在含有20%的胎牛血清、2mM左旋谷氨酰氨(L-Glu)、100~U/ml青霉素,100μg/ml鏈霉素的低糖型培養(yǎng)基(HG-DMEM)中培養(yǎng),原代培養(yǎng)3-7天后,顯微鏡下可見大量細胞自組織塊中游出,向外呈放射狀貼壁生長。待細胞達到80%-90%匯合后,加入0.2%胰酶消化傳代。收集MSCs臍帶間充質干細胞后凍存待用。(2)膠原酶-胰酶消化法:分別取足月妊娠剖宮產健康胎兒的臍帶17例及流產胎兒臍帶15例,超凈臺內取出臍帶PBS充分洗滌,沖去臍靜脈及動脈內的殘存血,將臍帶剪碎至1 mm3大小組織塊,移至0.1%膠原酶Ⅳ中,37℃持續(xù)攪拌消化30 min;隨即向膠原酶-組織塊消化體系內加入終濃度為0.1%的胰酶在37℃環(huán)境中繼續(xù)攪拌消化30 min;10% FBS終止消化,用細胞篩過濾,將含細胞的濾液進行離心。細胞接種于LG-DMEM培養(yǎng)基的T-25塑料培養(yǎng)瓶中。3,4 d后,更換培養(yǎng)基,去掉未貼壁細胞。以后每3天換液1次,至細胞融合傳代。 2將貼壁的干細胞消化。加入0.2%胰酶/0.2%EDTA,待細胞大部分變成圓形后,加入含有10%FBS的DMEM中止消化,吹打貼壁細胞使貼壁細胞變成懸浮狀態(tài)。1000rpm離心10分鐘,棄上清液,PBS洗滌(去除剩余的血清等)。室溫下,1000rpm離心10分鐘,臺盼藍染色法評估細胞活性,并進行細胞計數。安每管3-4×10 5分成12管各管中加入下述PE、FITC、PERCP、及APC標記的小鼠抗人單克隆抗體5ul,充分混勻,4℃避光孵育30分鐘。1800rpm離心5分鐘,去除上清液,加入2MLPBS 1000rpm離心兩次,各5分鐘。調整最終容積為200ML,上機進行流式細胞檢測。同時以小鼠FITC、PE、APC、PERCP標記的IgG1作為同型對照。所用抗體包括:PE-CD13、FITC-CD14、APC-CD29、FITC-CD31、FITC-CD34、PE-CD38、PE-CD44、PERCP-CD45、APC-CD90、FITC-CD105、PE-CD133、PE-CD166、HLA-DR。 結果: 1組織塊原代培養(yǎng):足月齡臍帶組約1周左右,可見細胞自組織塊游出,貼壁呈放射狀生長,形態(tài)較均一,呈長梭形。經10天左右達到80%-90%匯合,鏡下可見細胞胞漿豐富,軸突伸長,多角狀。消化后以1:2-1:3的比例傳代細胞,接種約30分鐘后細胞開始貼壁,6-8小時貼壁完全,傳代后經換液3-5天完全匯合時鏡下可見細胞排列緊密,無序生長,小月齡臍帶組約4-5天左右可見細胞游出,經5天左右達到80%-90%匯合,細胞傳代增殖特點與足月組相似。第2天即看見有少量形態(tài)各異的貼壁細胞,散在分布。 2膠原酶-胰酶消化法:第2天即看見有少量形態(tài)各異的貼壁細胞,散在分布長梭形細胞間可見少量鵝卵石樣細胞組成的集落,考慮為臍靜脈內皮細胞。長梭形細胞即為MSC細胞,其形態(tài)類似于成纖維細胞,增殖能力旺盛,約1周左右時,貼壁細胞形成集落,占優(yōu)勢的是成纖維樣細胞,此外還有臍靜脈內皮細胞,至2周左右可達到80%融合,臍靜脈內皮細胞生長則受到明顯抑制。2.5g/L胰酶消化,傳代后可得到較純化的成纖維樣細胞。 3流式細胞學檢測結果顯示:對小月齡胎兒臍帶培養(yǎng)的間充質干細胞進行免疫表型分析表明:CD13、CD29、CD44、CD90、CD105均呈陽性表達,本實驗結果表明,UCMSCs表達間充質細胞特異性抗原標志而不表達造血干細胞、內皮細胞特異性標志。這和足月胎兒臍帶流式檢測結果一致。并與骨髓、臍血、胎肺等其他組織來源的MSCs流式檢測結果也一致。對CD13、CD29、CD44、CD90的表達達97%以上說明細胞成分比較均一。 4統(tǒng)計學分析結果顯示:UC-MSC的原代培養(yǎng)中小月齡胎兒組細胞爬出、首次達80%融合時間、細胞總數達到10~6的時間及培養(yǎng)成功率均明顯早于足月胎兒組,具有統(tǒng)計學意義( P 0.05 ),傳代以后的細胞增值時間相近,無統(tǒng)計學意義( P 0.05)。組織貼塊組成功率明顯高于酶源消化法,具有統(tǒng)計學意義( P 0.05 )。 結論: 本實驗中小月齡胎兒臍帶培養(yǎng)的MSC在原代培養(yǎng)中周期明顯較足月胎兒臍帶培養(yǎng)的MSC短,應用組織貼塊法培養(yǎng)成功率高于酶原消化法,可在更短時間內獲的所需細胞數量。不同月齡的MSC的傳代增殖特性無明顯差異。臍帶來源的MSC在體外易擴增純化,增殖能力強,小月齡UCMSCs表達間充質細胞特異性抗原標志而不表達造血干細胞、內皮細胞特異性標志。這和足月胎兒UCMSCs流式檢測結果一致。并與骨髓、臍血、胎肺等其他組織來源的MSCs流式檢測結果也一致。
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【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R329

【引證文獻】

相關期刊論文 前1條

1 李曉玲;朱旅云;趙芳;;臍帶Wharton'sJelly中間充質干細胞的生物學特性[J];中國組織工程研究與臨床康復;2011年32期

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1 蔣潔;人臍帶沃頓膠間充質干細胞的分離培養(yǎng)及其誘導分化[D];中南大學;2010年

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本文編號：1769444