本文選題：臍帶 + 間充質(zhì)干細(xì)胞��； 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2007年碩士論文

【摘要】： 目的:人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞作為一種新的種子細(xì)胞來源越來越受到人們的重視。先前的研究表明從人臍帶組織中分離的間充質(zhì)干細(xì)胞既具有增殖能力,又具有向多細(xì)胞(神經(jīng)元樣細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞等)分化的能力,加之來源廣泛、取材容易,在細(xì)胞移植、基因治療、組織工程中有廣闊的應(yīng)用前景。然而,我們?cè)谶^去四年的研究中體會(huì)到從人臍帶分離間充質(zhì)干細(xì)胞并非易事,特別是如何快速、高效的從臍帶中獲得MSC以滿足基礎(chǔ)和未來臨床研究的需要是一個(gè)亟待解決的問題。為此,本課題對(duì)不同胎齡胎兒臍帶和不同培養(yǎng)方法對(duì)分離人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的影響進(jìn)行了研究。 方法: 1人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng):(1)組織貼塊法:分別取足月妊娠剖宮產(chǎn)健康胎兒的臍帶35例及流產(chǎn)胎兒臍帶33例,以PBS充分沖洗,剔除臍帶動(dòng)、靜脈,將其余的臍帶間質(zhì)組織切割成直徑約1mm大小的組織塊,在含有20%的胎牛血清、2mM左旋谷氨酰氨(L-Glu)、100~U/ml青霉素,100μg/ml鏈霉素的低糖型培養(yǎng)基(HG-DMEM)中培養(yǎng),原代培養(yǎng)3-7天后,顯微鏡下可見大量細(xì)胞自組織塊中游出,向外呈放射狀貼壁生長(zhǎng)。待細(xì)胞達(dá)到80%-90%匯合后,加入0.2%胰酶消化傳代。收集MSCs臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞后凍存待用。(2)膠原酶-胰酶消化法:分別取足月妊娠剖宮產(chǎn)健康胎兒的臍帶17例及流產(chǎn)胎兒臍帶15例,超凈臺(tái)內(nèi)取出臍帶PBS充分洗滌,沖去臍靜脈及動(dòng)脈內(nèi)的殘存血,將臍帶剪碎至1 mm3大小組織塊,移至0.1%膠原酶Ⅳ中,37℃持續(xù)攪拌消化30 min;隨即向膠原酶-組織塊消化體系內(nèi)加入終濃度為0.1%的胰酶在37℃環(huán)境中繼續(xù)攪拌消化30 min;10% FBS終止消化,用細(xì)胞篩過濾,將含細(xì)胞的濾液進(jìn)行離心。細(xì)胞接種于LG-DMEM培養(yǎng)基的T-25塑料培養(yǎng)瓶中。3,4 d后,更換培養(yǎng)基,去掉未貼壁細(xì)胞。以后每3天換液1次,至細(xì)胞融合傳代。 2將貼壁的干細(xì)胞消化。加入0.2%胰酶/0.2%EDTA,待細(xì)胞大部分變成圓形后,加入含有10%FBS的DMEM中止消化,吹打貼壁細(xì)胞使貼壁細(xì)胞變成懸浮狀態(tài)。1000rpm離心10分鐘,棄上清液,PBS洗滌(去除剩余的血清等)。室溫下,1000rpm離心10分鐘,臺(tái)盼藍(lán)染色法評(píng)估細(xì)胞活性,并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。安每管3-4×10 5分成12管各管中加入下述PE、FITC、PERCP、及APC標(biāo)記的小鼠抗人單克隆抗體5ul,充分混勻,4℃避光孵育30分鐘。1800rpm離心5分鐘,去除上清液,加入2MLPBS 1000rpm離心兩次,各5分鐘。調(diào)整最終容積為200ML,上機(jī)進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)。同時(shí)以小鼠FITC、PE、APC、PERCP標(biāo)記的IgG1作為同型對(duì)照。所用抗體包括:PE-CD13、FITC-CD14、APC-CD29、FITC-CD31、FITC-CD34、PE-CD38、PE-CD44、PERCP-CD45、APC-CD90、FITC-CD105、PE-CD133、PE-CD166、HLA-DR。 結(jié)果: 1組織塊原代培養(yǎng):足月齡臍帶組約1周左右,可見細(xì)胞自組織塊游出,貼壁呈放射狀生長(zhǎng),形態(tài)較均一,呈長(zhǎng)梭形。經(jīng)10天左右達(dá)到80%-90%匯合,鏡下可見細(xì)胞胞漿豐富,軸突伸長(zhǎng),多角狀。消化后以1:2-1:3的比例傳代細(xì)胞,接種約30分鐘后細(xì)胞開始貼壁,6-8小時(shí)貼壁完全,傳代后經(jīng)換液3-5天完全匯合時(shí)鏡下可見細(xì)胞排列緊密,無序生長(zhǎng),小月齡臍帶組約4-5天左右可見細(xì)胞游出,經(jīng)5天左右達(dá)到80%-90%匯合,細(xì)胞傳代增殖特點(diǎn)與足月組相似。第2天即看見有少量形態(tài)各異的貼壁細(xì)胞,散在分布。 2膠原酶-胰酶消化法:第2天即看見有少量形態(tài)各異的貼壁細(xì)胞,散在分布長(zhǎng)梭形細(xì)胞間可見少量鵝卵石樣細(xì)胞組成的集落,考慮為臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。長(zhǎng)梭形細(xì)胞即為MSC細(xì)胞,其形態(tài)類似于成纖維細(xì)胞,增殖能力旺盛,約1周左右時(shí),貼壁細(xì)胞形成集落,占優(yōu)勢(shì)的是成纖維樣細(xì)胞,此外還有臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,至2周左右可達(dá)到80%融合,臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)則受到明顯抑制。2.5g/L胰酶消化,傳代后可得到較純化的成纖維樣細(xì)胞。 3流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示:對(duì)小月齡胎兒臍帶培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行免疫表型分析表明:CD13、CD29、CD44、CD90、CD105均呈陽性表達(dá),本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,UCMSCs表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞特異性抗原標(biāo)志而不表達(dá)造血干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志。這和足月胎兒臍帶流式檢測(cè)結(jié)果一致。并與骨髓、臍血、胎肺等其他組織來源的MSCs流式檢測(cè)結(jié)果也一致。對(duì)CD13、CD29、CD44、CD90的表達(dá)達(dá)97%以上說明細(xì)胞成分比較均一。 4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示:UC-MSC的原代培養(yǎng)中小月齡胎兒組細(xì)胞爬出、首次達(dá)80%融合時(shí)間、細(xì)胞總數(shù)達(dá)到10~6的時(shí)間及培養(yǎng)成功率均明顯早于足月胎兒組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P 0.05 ),傳代以后的細(xì)胞增值時(shí)間相近,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P 0.05)。組織貼塊組成功率明顯高于酶源消化法,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P 0.05 )。 結(jié)論: 本實(shí)驗(yàn)中小月齡胎兒臍帶培養(yǎng)的MSC在原代培養(yǎng)中周期明顯較足月胎兒臍帶培養(yǎng)的MSC短,應(yīng)用組織貼塊法培養(yǎng)成功率高于酶原消化法,可在更短時(shí)間內(nèi)獲的所需細(xì)胞數(shù)量。不同月齡的MSC的傳代增殖特性無明顯差異。臍帶來源的MSC在體外易擴(kuò)增純化,增殖能力強(qiáng),小月齡UCMSCs表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞特異性抗原標(biāo)志而不表達(dá)造血干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志。這和足月胎兒UCMSCs流式檢測(cè)結(jié)果一致。并與骨髓、臍血、胎肺等其他組織來源的MSCs流式檢測(cè)結(jié)果也一致。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R329

【引證文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1769444