本文選題：霍亂 + O1群小川型霍亂弧菌　； 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2007年博士論文

【摘要】： 霍亂(cholera)是由霍亂弧菌引起的烈性腸道傳染病,該病起病急、傳播快、涉及范圍廣,可引起爆發(fā)流行,屬國際檢疫傳染病,在我國被列為甲類傳染病之一,從有記載開始霍亂已引起七次世界范圍大流行,時時威脅著人類健康�；魜y弧菌血清群超過200個,但只有O1群及O139群引起霍亂大流行。O1群霍亂弧菌分為稻葉、小川和彥島(少見)三種血清型,O139群不再分型。各型弧菌產(chǎn)生類似的腸毒素,臨床表現(xiàn)也較為相似。 目前對霍亂爆發(fā)的應(yīng)答是以組織良好的緊急應(yīng)答形式作出反應(yīng),雖然能防止許多死亡,但不能預(yù)防霍亂疫情的發(fā)生;每一次霍亂流行都會有一個特定的優(yōu)勢株,且流行趨勢不斷變化。因此,建立有效的快速反應(yīng)機制和應(yīng)對策略具有重要意義�；魜y的快速檢驗平臺的建立有利于霍亂流行的監(jiān)測與預(yù)防,通過針對霍亂弧菌的特異性單抗開發(fā)的膠體金試紙條,可快速、簡便、準(zhǔn)確地檢測霍亂弧菌,無需特殊的儀器設(shè)備,適于現(xiàn)場和基層使用。疫苗則是從根本上消除霍亂威脅的最為有效手段,中期和長期預(yù)防措施的持續(xù)結(jié)合在霍亂防控中具有重要作用,所以開發(fā)安全高效的新型疫苗顯得十分必要,其中有效疫苗候選表位的篩選是得到安全、高效的新型霍亂疫苗的關(guān)鍵,噬菌體隨機肽庫技術(shù)則是目前抗原表位高通量篩選最為有效的工具。 在本課題中,我們采用滅活的O1群小川型、稻葉型及O139群霍亂弧菌為抗原,通過雜交瘤技術(shù)制備針對霍亂弧菌的單克隆抗體,并通過一步法配對篩選技術(shù)平臺得到2株高特異性高活性的O1群小川型霍亂弧菌單抗IXiao3G6和IXiao1D9,并以此為基礎(chǔ)研制成功O1群小川型霍亂的膠體金試紙條,為臨床霍亂病例診斷、高危人群監(jiān)測、流行病學(xué)調(diào)查及衛(wèi)生檢疫等提供快速、簡便、準(zhǔn)確的檢測手段。在此基礎(chǔ)上以IXiao3G6單抗為靶標(biāo),應(yīng)用噬菌體隨機肽庫技術(shù)進(jìn)行了霍亂弧菌模擬肽篩選,通過對篩選出的模擬肽(mimic peptide,MP)基因優(yōu)化設(shè)計,實現(xiàn)串聯(lián)重復(fù),構(gòu)建含模擬肽與霍亂毒素B亞單位(CTB)編碼基因嵌合表達(dá)的重組質(zhì)粒,并在大腸桿菌BL21中表達(dá),鑒定其抗原性,為基于表位的霍亂弧菌模擬多肽疫苗的開發(fā)與設(shè)計提供實驗基礎(chǔ)。 第一部分 霍亂弧菌單克隆抗體的制備及篩選 目的制備并篩選出高特異性高活性的抗霍亂弧菌單克隆抗體(McAb),為霍亂的預(yù)防診斷提供有力的抗體工具。 方法以滅活的O1群小川型、稻葉型及O139群霍亂弧菌免疫Balb/c小鼠,通過雜交瘤技術(shù)制備針對霍亂弧菌的McAb,以間接ELISA法對所需的雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行第一輪篩選,除了用O1群小川型、稻葉型及O139群霍亂弧菌的菌體抗原進(jìn)行特異性篩選外,還選用了多種包括弧菌科及其他常見細(xì)菌在內(nèi)的菌體抗原進(jìn)行排除性篩選。第二輪篩選采用獨特的“單抗金標(biāo)平行快速篩選技術(shù)”建立單克隆抗體細(xì)胞株配對篩選技術(shù)平臺,將純化單抗標(biāo)記膠體金和包被硝酸纖維素膜后兩兩組合配對篩選。 結(jié)果用間接ELISA經(jīng)特異性初篩,共篩選出602株能分泌抗O1群小川型霍亂弧菌單抗、386株能分泌抗O1群稻葉型霍亂弧菌單抗、82株能分泌抗O139群霍亂弧菌單抗的雜交瘤細(xì)胞株。此后重復(fù)進(jìn)行間接ELISA特異性篩選及交叉反應(yīng)篩選,得到15株只分泌抗O1群小川型霍亂弧菌的特異性McAb、15株只分泌抗O1群稻葉型霍亂弧菌的特異性McAb、10株只分泌抗O139群霍亂弧菌的特異性McAb的細(xì)胞株。經(jīng)配對篩選,最后篩選出兩株只針對O1群小川型霍亂弧菌高特異性高活性的單抗:X8 (IXiao3G6)和X2 (IXiao1D9)。結(jié)論獲得兩株只針對O1群小川型霍亂弧菌高特異性高活性的McAb,為O1群小川型霍亂早期快速診斷和預(yù)防的研究提供基礎(chǔ)。 第二部分特異性O(shè)1群小川型霍亂弧菌單克隆抗體的鑒定及應(yīng)用 目的本部分我們首先對所獲得的2株只針對O1群小川型霍亂弧菌的單抗細(xì)胞株IXiao3G6和IXiao1D9進(jìn)行理化性質(zhì)的鑒定和生物學(xué)特性的研究,然后用這2株單抗研制O1群小川型霍亂弧菌膠體金快速檢測卡,建立以單克隆抗體為基礎(chǔ)的雙抗夾心法膜式超靈敏膠體金快速檢測方法,用于霍亂的早期診斷。 方法首先對篩選到的高特異性的兩株單抗進(jìn)行了分離、純化及鑒定:先通過飽和硫酸銨鹽析的方法粗提抗體,再用Protein A親和層析法進(jìn)一步純化,然后對單抗進(jìn)行了包括染色體分析,亞型鑒定,效價、親和常數(shù)的測定以及特異性的鑒定與分析,并通過單克隆抗體的位點相加實驗、與O1群小川型霍亂弧菌LPS的間接ELISA和western blot實驗對兩株單抗識別的抗原表位進(jìn)行了初步研究。然后采用高度特異性的抗原抗體反應(yīng)及膠體金標(biāo)記技術(shù),通過雙抗體夾心法(抗體-抗原-抗體),以2株單抗作為包被及標(biāo)記抗體,制備膠體金-抗體結(jié)合物和反應(yīng)膜,研制霍亂弧菌膠體金快速檢測卡,并通過特異性、靈敏度、重復(fù)性及穩(wěn)定性的檢測進(jìn)行方法學(xué)評價。 結(jié)果SDS-PAGE結(jié)果表明,純化后單抗純度達(dá)95%以上,經(jīng)鑒定兩株單抗亞類分別為IgG2b及IgG3,特異性好、親和力高(親和常數(shù)為109)、效價高(腹水效價均達(dá)10-6),對兩株單抗識別的抗原表位進(jìn)行初步研究表明兩株單抗針對的是不同抗原表位,IXiao3G6針對O1群小川型霍亂弧菌脂多糖,而IXiao1D9針對非脂多糖抗原位點。制備了O1群小川型霍亂弧菌膠體金快速檢測試紙卡,實現(xiàn)對O1群小川型霍亂弧菌菌體抗原的特異檢測,建立了單克隆抗體夾心法-膠體金試紙條檢測霍亂弧菌的方法,初步試驗結(jié)果證明,該法具有很好的特異性(100%)和靈敏度(最低檢出量1×104cfu/ml),重復(fù)性100%,穩(wěn)定性好(室溫保存一年也不失活),檢測時間快(5分鐘可判定結(jié)果),操作簡便等優(yōu)點。 結(jié)論對篩選到的高特異性的兩株單抗進(jìn)行分離、純化及鑒定,進(jìn)一步證實這兩株單抗達(dá)到了診斷用抗體親和力的要求,對下步模擬表位的篩選及獲得能誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)的模擬肽也有重要的應(yīng)用價值。O1群小川型霍亂弧菌膠體金快速檢測卡能夠特異檢測O1群小川型霍亂弧菌,操作簡單,結(jié)果判定清晰可靠,解決了現(xiàn)霍亂檢測中無法對小川及稻葉型區(qū)別檢測的問題,彌補了國內(nèi)國際霍亂檢測試劑盒的一個缺口和空白點,為臨床診斷、食品安全檢測、環(huán)境衛(wèi)生監(jiān)測、反恐和出入境檢疫等提供有效的檢測手段。 第三部分O1群小川型霍亂弧菌單克隆抗體識別表位模擬肽的篩選鑒定 目的以純化的有高度特異性的IXiao3G6單抗為靶分子,對噬菌體隨機7肽庫進(jìn)行淘篩,以期篩選到與O1群小川型霍亂弧菌單抗有高親和力的模擬肽,為基于表位的霍亂弧菌模擬多肽疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。 方法運用噬菌體隨機七肽庫技術(shù),以純化的IXiao3G6單抗為靶蛋白,進(jìn)行噬菌體隨機肽庫3輪篩選,以雙抗夾心ELISA和競爭抑制試驗分析獲得的噬菌體短肽與篩選配基的結(jié)合能力及特異性,并進(jìn)行陽性克隆序列測定和同源性分析。 結(jié)果三輪篩選后,陽性噬菌體得到有效富集,夾心ELISA檢測隨機挑取的25個噬菌體克隆,有22個噬菌體克隆為陽性,測序表明其中20個陽性克隆的氨基酸序列完全一致,均為APAIPAS。對該序列同源性分析,未發(fā)現(xiàn)有相同的已知序列。競爭抑制試驗表明,O1群小川型霍亂弧菌LPS能很好地抑制陽性克隆與IXiao3G6 McAb的結(jié)合,抑制程度隨LPS濃度的升高而增加,而對照細(xì)菌的LPS則不具有相應(yīng)的抑制作用,進(jìn)一步提示噬菌體克隆展示肽模擬了O1群小川型霍亂弧菌LPS抗原表位。 結(jié)論篩選到模擬O1群小川型霍亂弧菌LPS的抗原表位的模擬肽,為基于表位的霍亂弧菌模擬多肽疫苗的開發(fā)與設(shè)計提供了實驗依據(jù)。 第四部分O1群小川型霍亂弧菌模擬肽與霍亂毒素B亞單位的重組表達(dá)及抗原性分析 目的對篩選的模擬O1群小川型霍亂弧菌LPS抗原表位的MP基因?qū)崿F(xiàn)串聯(lián)重復(fù),構(gòu)建含MP與霍亂毒素B亞單位(CTB)編碼基因的重組質(zhì)粒,并在大腸桿菌BL21中表達(dá),鑒定其抗原性,為進(jìn)一步研制基于表位的霍亂弧菌模擬多肽疫苗奠定基礎(chǔ)。 方法用PCR方法擴增CTB目的基因片段,經(jīng)Kpn I、BamH I雙酶切后,與進(jìn)行同樣酶切處理的質(zhì)粒pET32a(+)在T4連接酶的作用下連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,通過鑒定、測序,構(gòu)建pET32a(+)-CTB重組質(zhì)粒。根據(jù)獲得的O1群小川型霍亂弧菌LPS模擬表位對應(yīng)的基因序列,設(shè)計寡核苷酸鏈,實現(xiàn)MP基因的串聯(lián)重復(fù),經(jīng)PCR得到模擬肽的核苷酸鏈,克隆至重組質(zhì)粒pET32a(+)-CTB的CTB基因下游,構(gòu)建含嵌合基因的重組質(zhì)粒pET32a(+)-CTB-MP,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE30),通過IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá),Ni-NTA試劑盒純化目的蛋白,用間接ELISA、western-blot檢測其抗原性,用競爭抑制試驗進(jìn)一步驗證MP是否模擬了O1群小川型霍亂弧菌LPS的抗原表位,還應(yīng)用ELISA檢測CTB與單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂GM-1的結(jié)合。 結(jié)果實現(xiàn)了串聯(lián)重復(fù)的O1群小川型霍亂弧菌LPS模擬肽(MP)與CTB的重組,SDS-PAGE顯示,IPTG誘導(dǎo)后CTB和CTB-MP蛋白均獲得高效表達(dá),相對分子量分別為32KD和34KD,與預(yù)期相符,目的蛋白純化后純度可達(dá)90%以上。間接ELISA、western-blot檢測表明CTB-MP融合蛋白可與IXiao3G6單抗結(jié)合,競爭抑制試驗表明CTB-MP可抑制IXiao3G6單抗與O1群小川型霍亂弧菌及O1群小川型霍亂弧菌LPS的結(jié)合,通過ELISA表明CTB與單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂GM-1的結(jié)合。 結(jié)論O1群小川型霍亂弧菌LPS模擬肽(MP)與CTB的重組蛋白可與O1群小川型霍亂弧菌單克隆抗體IXiao3G6反應(yīng),并可抑制IXiao3G6單抗與O1群小川型霍亂弧菌LPS的結(jié)合,提示該模擬肽可模擬O1群小川型霍亂弧菌LPS的表位。CTB與單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂GM-1能夠結(jié)合,表明CTB在模擬肽重組蛋白中也起了作用。
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【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1760057