本文選題：霍亂 + O1群小川型霍亂弧菌�。� 參考：《重慶醫(yī)科大學》2007年博士論文

【摘要】： 霍亂(cholera)是由霍亂弧菌引起的烈性腸道傳染病,該病起病急、傳播快、涉及范圍廣,可引起爆發(fā)流行,屬國際檢疫傳染病,在我國被列為甲類傳染病之一,從有記載開始霍亂已引起七次世界范圍大流行,時時威脅著人類健康�；魜y弧菌血清群超過200個,但只有O1群及O139群引起霍亂大流行。O1群霍亂弧菌分為稻葉、小川和彥島(少見)三種血清型,O139群不再分型。各型弧菌產生類似的腸毒素,臨床表現也較為相似。 目前對霍亂爆發(fā)的應答是以組織良好的緊急應答形式作出反應,雖然能防止許多死亡,但不能預防霍亂疫情的發(fā)生;每一次霍亂流行都會有一個特定的優(yōu)勢株,且流行趨勢不斷變化。因此,建立有效的快速反應機制和應對策略具有重要意義�；魜y的快速檢驗平臺的建立有利于霍亂流行的監(jiān)測與預防,通過針對霍亂弧菌的特異性單抗開發(fā)的膠體金試紙條,可快速、簡便、準確地檢測霍亂弧菌,無需特殊的儀器設備,適于現場和基層使用。疫苗則是從根本上消除霍亂威脅的最為有效手段,中期和長期預防措施的持續(xù)結合在霍亂防控中具有重要作用,所以開發(fā)安全高效的新型疫苗顯得十分必要,其中有效疫苗候選表位的篩選是得到安全、高效的新型霍亂疫苗的關鍵,噬菌體隨機肽庫技術則是目前抗原表位高通量篩選最為有效的工具。 在本課題中,我們采用滅活的O1群小川型、稻葉型及O139群霍亂弧菌為抗原,通過雜交瘤技術制備針對霍亂弧菌的單克隆抗體,并通過一步法配對篩選技術平臺得到2株高特異性高活性的O1群小川型霍亂弧菌單抗IXiao3G6和IXiao1D9,并以此為基礎研制成功O1群小川型霍亂的膠體金試紙條,為臨床霍亂病例診斷、高危人群監(jiān)測、流行病學調查及衛(wèi)生檢疫等提供快速、簡便、準確的檢測手段。在此基礎上以IXiao3G6單抗為靶標,應用噬菌體隨機肽庫技術進行了霍亂弧菌模擬肽篩選,通過對篩選出的模擬肽(mimic peptide,MP)基因優(yōu)化設計,實現串聯(lián)重復,構建含模擬肽與霍亂毒素B亞單位(CTB)編碼基因嵌合表達的重組質粒,并在大腸桿菌BL21中表達,鑒定其抗原性,為基于表位的霍亂弧菌模擬多肽疫苗的開發(fā)與設計提供實驗基礎。 第一部分 霍亂弧菌單克隆抗體的制備及篩選 目的制備并篩選出高特異性高活性的抗霍亂弧菌單克隆抗體(McAb),為霍亂的預防診斷提供有力的抗體工具。 方法以滅活的O1群小川型、稻葉型及O139群霍亂弧菌免疫Balb/c小鼠,通過雜交瘤技術制備針對霍亂弧菌的McAb,以間接ELISA法對所需的雜交瘤細胞株進行第一輪篩選,除了用O1群小川型、稻葉型及O139群霍亂弧菌的菌體抗原進行特異性篩選外,還選用了多種包括弧菌科及其他常見細菌在內的菌體抗原進行排除性篩選。第二輪篩選采用獨特的“單抗金標平行快速篩選技術”建立單克隆抗體細胞株配對篩選技術平臺,將純化單抗標記膠體金和包被硝酸纖維素膜后兩兩組合配對篩選。 結果用間接ELISA經特異性初篩,共篩選出602株能分泌抗O1群小川型霍亂弧菌單抗、386株能分泌抗O1群稻葉型霍亂弧菌單抗、82株能分泌抗O139群霍亂弧菌單抗的雜交瘤細胞株。此后重復進行間接ELISA特異性篩選及交叉反應篩選,得到15株只分泌抗O1群小川型霍亂弧菌的特異性McAb、15株只分泌抗O1群稻葉型霍亂弧菌的特異性McAb、10株只分泌抗O139群霍亂弧菌的特異性McAb的細胞株。經配對篩選,最后篩選出兩株只針對O1群小川型霍亂弧菌高特異性高活性的單抗:X8 (IXiao3G6)和X2 (IXiao1D9)。結論獲得兩株只針對O1群小川型霍亂弧菌高特異性高活性的McAb,為O1群小川型霍亂早期快速診斷和預防的研究提供基礎。 第二部分特異性O1群小川型霍亂弧菌單克隆抗體的鑒定及應用 目的本部分我們首先對所獲得的2株只針對O1群小川型霍亂弧菌的單抗細胞株IXiao3G6和IXiao1D9進行理化性質的鑒定和生物學特性的研究,然后用這2株單抗研制O1群小川型霍亂弧菌膠體金快速檢測卡,建立以單克隆抗體為基礎的雙抗夾心法膜式超靈敏膠體金快速檢測方法,用于霍亂的早期診斷。 方法首先對篩選到的高特異性的兩株單抗進行了分離、純化及鑒定:先通過飽和硫酸銨鹽析的方法粗提抗體,再用Protein A親和層析法進一步純化,然后對單抗進行了包括染色體分析,亞型鑒定,效價、親和常數的測定以及特異性的鑒定與分析,并通過單克隆抗體的位點相加實驗、與O1群小川型霍亂弧菌LPS的間接ELISA和western blot實驗對兩株單抗識別的抗原表位進行了初步研究。然后采用高度特異性的抗原抗體反應及膠體金標記技術,通過雙抗體夾心法(抗體-抗原-抗體),以2株單抗作為包被及標記抗體,制備膠體金-抗體結合物和反應膜,研制霍亂弧菌膠體金快速檢測卡,并通過特異性、靈敏度、重復性及穩(wěn)定性的檢測進行方法學評價。 結果SDS-PAGE結果表明,純化后單抗純度達95%以上,經鑒定兩株單抗亞類分別為IgG2b及IgG3,特異性好、親和力高(親和常數為109)、效價高(腹水效價均達10-6),對兩株單抗識別的抗原表位進行初步研究表明兩株單抗針對的是不同抗原表位,IXiao3G6針對O1群小川型霍亂弧菌脂多糖,而IXiao1D9針對非脂多糖抗原位點。制備了O1群小川型霍亂弧菌膠體金快速檢測試紙卡,實現對O1群小川型霍亂弧菌菌體抗原的特異檢測,建立了單克隆抗體夾心法-膠體金試紙條檢測霍亂弧菌的方法,初步試驗結果證明,該法具有很好的特異性(100%)和靈敏度(最低檢出量1×104cfu/ml),重復性100%,穩(wěn)定性好(室溫保存一年也不失活),檢測時間快(5分鐘可判定結果),操作簡便等優(yōu)點。 結論對篩選到的高特異性的兩株單抗進行分離、純化及鑒定,進一步證實這兩株單抗達到了診斷用抗體親和力的要求,對下步模擬表位的篩選及獲得能誘導保護性免疫反應的模擬肽也有重要的應用價值。O1群小川型霍亂弧菌膠體金快速檢測卡能夠特異檢測O1群小川型霍亂弧菌,操作簡單,結果判定清晰可靠,解決了現霍亂檢測中無法對小川及稻葉型區(qū)別檢測的問題,彌補了國內國際霍亂檢測試劑盒的一個缺口和空白點,為臨床診斷、食品安全檢測、環(huán)境衛(wèi)生監(jiān)測、反恐和出入境檢疫等提供有效的檢測手段。 第三部分O1群小川型霍亂弧菌單克隆抗體識別表位模擬肽的篩選鑒定 目的以純化的有高度特異性的IXiao3G6單抗為靶分子,對噬菌體隨機7肽庫進行淘篩,以期篩選到與O1群小川型霍亂弧菌單抗有高親和力的模擬肽,為基于表位的霍亂弧菌模擬多肽疫苗的研制奠定基礎。 方法運用噬菌體隨機七肽庫技術,以純化的IXiao3G6單抗為靶蛋白,進行噬菌體隨機肽庫3輪篩選,以雙抗夾心ELISA和競爭抑制試驗分析獲得的噬菌體短肽與篩選配基的結合能力及特異性,并進行陽性克隆序列測定和同源性分析。 結果三輪篩選后,陽性噬菌體得到有效富集,夾心ELISA檢測隨機挑取的25個噬菌體克隆,有22個噬菌體克隆為陽性,測序表明其中20個陽性克隆的氨基酸序列完全一致,均為APAIPAS。對該序列同源性分析,未發(fā)現有相同的已知序列。競爭抑制試驗表明,O1群小川型霍亂弧菌LPS能很好地抑制陽性克隆與IXiao3G6 McAb的結合,抑制程度隨LPS濃度的升高而增加,而對照細菌的LPS則不具有相應的抑制作用,進一步提示噬菌體克隆展示肽模擬了O1群小川型霍亂弧菌LPS抗原表位。 結論篩選到模擬O1群小川型霍亂弧菌LPS的抗原表位的模擬肽,為基于表位的霍亂弧菌模擬多肽疫苗的開發(fā)與設計提供了實驗依據。 第四部分O1群小川型霍亂弧菌模擬肽與霍亂毒素B亞單位的重組表達及抗原性分析 目的對篩選的模擬O1群小川型霍亂弧菌LPS抗原表位的MP基因實現串聯(lián)重復,構建含MP與霍亂毒素B亞單位(CTB)編碼基因的重組質粒,并在大腸桿菌BL21中表達,鑒定其抗原性,為進一步研制基于表位的霍亂弧菌模擬多肽疫苗奠定基礎。 方法用PCR方法擴增CTB目的基因片段,經Kpn I、BamH I雙酶切后,與進行同樣酶切處理的質粒pET32a(+)在T4連接酶的作用下連接,轉化大腸桿菌JM109,通過鑒定、測序,構建pET32a(+)-CTB重組質粒。根據獲得的O1群小川型霍亂弧菌LPS模擬表位對應的基因序列,設計寡核苷酸鏈,實現MP基因的串聯(lián)重復,經PCR得到模擬肽的核苷酸鏈,克隆至重組質粒pET32a(+)-CTB的CTB基因下游,構建含嵌合基因的重組質粒pET32a(+)-CTB-MP,轉化大腸桿菌BL21(DE30),通過IPTG誘導蛋白表達,Ni-NTA試劑盒純化目的蛋白,用間接ELISA、western-blot檢測其抗原性,用競爭抑制試驗進一步驗證MP是否模擬了O1群小川型霍亂弧菌LPS的抗原表位,還應用ELISA檢測CTB與單唾液酸神經節(jié)苷脂GM-1的結合。 結果實現了串聯(lián)重復的O1群小川型霍亂弧菌LPS模擬肽(MP)與CTB的重組,SDS-PAGE顯示,IPTG誘導后CTB和CTB-MP蛋白均獲得高效表達,相對分子量分別為32KD和34KD,與預期相符,目的蛋白純化后純度可達90%以上。間接ELISA、western-blot檢測表明CTB-MP融合蛋白可與IXiao3G6單抗結合,競爭抑制試驗表明CTB-MP可抑制IXiao3G6單抗與O1群小川型霍亂弧菌及O1群小川型霍亂弧菌LPS的結合,通過ELISA表明CTB與單唾液酸神經節(jié)苷脂GM-1的結合。 結論O1群小川型霍亂弧菌LPS模擬肽(MP)與CTB的重組蛋白可與O1群小川型霍亂弧菌單克隆抗體IXiao3G6反應,并可抑制IXiao3G6單抗與O1群小川型霍亂弧菌LPS的結合,提示該模擬肽可模擬O1群小川型霍亂弧菌LPS的表位。CTB與單唾液酸神經節(jié)苷脂GM-1能夠結合,表明CTB在模擬肽重組蛋白中也起了作用。
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【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：1760057